二代測序DNA快速建庫試劑盒的品牌是百奧萊博，是優(yōu)質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品，本制品用于生化實驗研究等領(lǐng)域，我公司專注于基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的二代測序DNA快速建庫試劑盒質(zhì)量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括二代測序DNA快速建庫試劑盒(Illumina平臺)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：二代測序DNA快速建庫試劑盒(Illumina平臺)
英文名稱：NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina
產(chǎn)品貨號：WE0229
產(chǎn)品規(guī)格：24次|96次

  本試劑盒提供了DNA文庫構(gòu)建所需要的酶預混體系及反應(yīng)緩沖液，包含除接頭與PCR引物外的所有成分，用于illumina二代測序平臺DNA文庫構(gòu)建。和一般建庫方法相比，該試劑盒操作簡單、方便，大地縮短了文庫構(gòu)建時間。另外，試劑盒采用高保真DNA聚合酶進行文庫富集，無偏好的PCR擴增，擴大了序列的覆蓋區(qū)域，可制備用于illumina二代測序平臺的DNA文庫。試劑盒中提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證，zuì大程度上保證了文庫構(gòu)建的穩(wěn)定性。

試劑盒組成：

組份	24次	96次
End Prep Enzyme Mix	48μl	192μl
10x End Repair Reaction Buffer	200μl	800μl
T4 DNA ligase	48μl	192μl
T4 DNA ligase Buffer	400μl	2×800μl
HiFidelity 2×PCRMasterMix	600μl	2×1.2ml

試劑盒特點;
1、末端補平，磷酸化，加A一步完成。
2、不需純化，直接加接頭。
3、超保真擴增，zuì大程度上降低了擴增偏好性。
4、支持多種樣本，且所得文庫能夠用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq 2500/2000/1000和MiSeq sequencing等測序平臺的測序。

自備儀器、試劑和耗材：
1、磁力架：建議使用DynaMagTM-2(貨號： 12321D)。
2、DNA純化回收試劑盒：建議使用百奧萊博磁珠法DNA純化回收試劑盒(貨號： WE0205)。
3、樣本接頭引物試劑盒：建議使用百奧萊博二代測序多樣本接頭引物試劑盒 I/II(貨號：WE0241/WE0240)。
4、無水乙醇，EB(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)，去離子水(pH 在7.0-8.0之間)。
5、反應(yīng)管：建議使用低吸附的PCR管與1.5ml離心管；槍頭：建議使用高質(zhì)量過濾槍頭防止試劑盒、文庫樣本污染

實驗前準備及重要注意事項：
1、避免試劑的反復凍融，建議您次使用試劑盒后將剩余試劑分裝保存。
2、PCR產(chǎn)物因操作不當易產(chǎn)生污染，導致實驗結(jié)果不準確，建議將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)與PCR產(chǎn)物純化區(qū)隔離，并使用專門的移液器，定時對各實驗區(qū)域進行清潔。

DNA建庫流程示意圖：



操作步驟：

樣本要求： 5ng-1μg打斷的雙鏈DNA，溶于EB(10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去離子水中。DNA純度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。

DNA末端修復反應(yīng)：
1、向200μl PCR管中加入以下試劑：

試劑	體積
10×End Repair Reaction Buffer	6.5μl
End Prep Enzyme Mix	2μl
fragmented DNA	X(5ng-1μg)
RNase-free Water	Up to 65μl

2、用槍頭將上述溶液輕輕吹吸混勻，短暫離心,使所有組分收集到管底。
3、將上述PCR管置于PCR儀中，熱蓋打開， 反應(yīng)程序如下：
15 min @ 12℃
15 min @ 37℃
20 min @ 72℃

Adaptor 連接：
建議使用百奧萊博adaptor進行連接，也可選擇使用NEB、illumina公司的adaptor，具體連接方法可參考各公司的產(chǎn)品使用說明書。以下為使用百奧萊博adaptor進行連接的操作步驟：
1、向上述已完成DNA末端修復的反應(yīng)液中直接加入以下試劑：

試劑	體積
T4 DNA ligase buffer for illumina	14μl
T4 DNA ligase	2μl
Adaptor	2.5μl

此時管中溶液總體積為83.5μl。
注意：若起始樣本量少于100ng，請將adaptor用去離子水稀釋10倍至1.5μM后使用。
2、用槍頭將上述試劑吹吸混勻，短暫離心，使溶液收集到管底。
3、20℃溫浴15分鐘。
注意：若此操作使用pcr儀，請將熱蓋關(guān)閉。

DNA片段的選擇性回收：
  建議使用百奧萊博磁珠法DNA純化回收試劑盒(WE0205)進行DNA片段選擇性回收。
注意：DNA片段選擇性回收是可選步驟，若起始樣本量低于50ng，不建議進行DNA片段選擇性回收，直接進行DNA片段的純化。另外構(gòu)建不同大小的DNA文庫時，DNA片段選擇性回收的磁珠使用量不同，具體磁珠用量可參照附表1(若使用除百奧萊博以外廠家的磁珠，需自行摸索zuì佳磁珠用量)。
  以下操作步驟中，可選擇回收DNA片段長度峰值為320bp(插入片段長度200bp)，反應(yīng)起始體積為100μl。
1、渦旋振蕩MCPure20秒，使其徹底混勻為均一溶液。
2、向連接反應(yīng)液中加入16.5μl去離子水，使adaptor連接反應(yīng)緩沖液體積至100μl。
注意：若使用NEB adaptor，只需要加入13.5μl去離子水。
3、將上述adaptor反應(yīng)緩沖液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中。
4、加入70μl混合均勻的MCPure，渦旋震蕩5秒鐘后, 室溫靜置5分鐘。
5、短暫離心，將離心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清(約需5分鐘)，小心地將上清溶液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中,并棄去磁珠。
注意：不要棄除上清。
6、向上清中加入25μl混合均勻的MCPure，渦旋震蕩5秒鐘后室溫放置5分鐘。
7、短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清(約需5分鐘)，小心吸取上清并棄除，期間避免接觸已結(jié)合目標DNA的磁珠。
注意：不要棄除磁珠。
8、繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入250μl新配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠完全吸附后，小心棄除上清。
9、重復步驟8。
10、保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。
11、將離心管從磁力架上取下，加入28μl 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)或去離子水(自備)，渦旋振蕩使磁珠完全重懸于洗脫液中，室溫靜置5分鐘。
12、短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清(約需5分鐘)，將23μl洗脫液轉(zhuǎn)移至一個新的PCR管中；
注意：一定不要轉(zhuǎn)移磁珠，微量磁珠污染可影響后續(xù)PCR反應(yīng)的正常進行。

另一種方案： DNA片段的純化：
1、渦旋振蕩MCPure20秒，使其徹底混勻為均一溶液。
2、將adaptor連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中。
3、加入1倍樣品體積的MCPure，渦旋震蕩5秒鐘后，室溫靜置5分鐘。
4、短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清(約需5分鐘)，小心吸取上清并棄除，期間避免接觸已結(jié)合目標DNA的磁珠。
注意：不要棄除磁珠。
5、繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入250μl新鮮配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠完全吸附后，小心棄除上清。
6、重復步驟5。
7、保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。
8、將離心管從磁力架上取下，加入28μl EB(自備)或去離子水，渦旋振蕩使磁珠完全重懸于洗脫液中，室溫靜置5分鐘。
9、短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清(約需5分鐘)，將23μl洗脫液轉(zhuǎn)移至一個新的PCR管中。

附表1：不同片段選擇回收時磁珠建議用量

DNA文庫大小	插入片段	150bp	200bp	250bp	300-400bp	400-500bp	500-700bp
	插入片段+adaptor	270bp	320bp	400bp	400-500bp	500-600bp	600-800bp
磁珠用量	次選擇	85	70	55	50	45	35
	第二次選擇	25	25	20	20	20	15

PCR擴增：
1．在PCR管中加入以下試劑并混勻。

試劑	體積
連接adaptor后的DNA片段	23μl
2×HiFid elity PCR Mix	25μl
Univesial primer	1μl
Index primer	1μl
總體積	50μl

2、PCR反應(yīng)條件：

步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預變性	98℃	30 s
變性	98℃	10 s	6-16個循環(huán)
退火	65℃	30 s
延伸	72℃	30 s
終延伸	72℃	5 min

注意：建議1μg樣本起始量時PCR循環(huán)數(shù)為6個循環(huán)，50ng時10個循環(huán)，5ng時14-15個循環(huán)，PCR循環(huán)數(shù)也可根據(jù)實驗需要進行優(yōu)化。

PCR產(chǎn)物的純化：
1、渦旋振蕩MCPure20秒，使其徹底混勻為均一溶液。
2、將PCR反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中。
3、加入1倍樣品體積的MCPure，渦旋震蕩5秒鐘后室溫靜置5分鐘。
4、短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清(約需5分鐘)。小心吸取上清并棄除，期間避免接觸已結(jié)合目標DNA的磁珠。
注意：不要棄除磁珠。
5、繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入250μl新鮮配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠完全吸附后，小心棄除上清。
6、重復步驟5。
7、保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。
8、將離心管從磁力架上取下，加入30μl EB(自備)或去離子水，渦旋振蕩使磁珠完全重懸于洗脫液中，室溫靜置5分鐘。
9、短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清(約需5分鐘)，將洗脫液轉(zhuǎn)移至一個新的PCR管中約25μl，DNA文庫在-20℃保存。

文庫質(zhì)量檢測

文庫濃度：
  為了得到高質(zhì)量的測序結(jié)果，需要對DNA文庫進行定量，先推薦使用Real-time PCR方法對DNA文庫進行定量。此外，還可使用熒光染料法，如Qubit法或熒光染料picogreen法，此處請勿使用基于吸光度測量的定量方法。zuì終可使用以下近似公式換算DNA文庫的摩爾濃度。

文庫平均總長度	近似轉(zhuǎn)換公式	成簇反應(yīng)DNA文庫濃度
200 bp	1ng/μl=7.5 nM	6-12 pM
300 bp	1ng/μl=5.0 nM	6-12 pM
400 bp	1ng/μl=3.8 nM	6-12 pM
500 bp	1ng/μl=3.0 nM	6-12 pM

文庫長度分布
制備好的DNA文庫可用瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2100 Bioanalyzer檢測DNA文庫中的片段長度分布范圍。


圖1：Agilent 2100 Bioanalyzer文庫分析結(jié)果
L：DNA Ladder；
S：使用200ng人基因組DNA構(gòu)建文庫，磁珠進行選擇回收后結(jié)果。

文庫結(jié)構(gòu)
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
NNNNNN：index, 6bases

儲存條件：-20℃

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名稱：Caspase-1 mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0189
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預雜交液 2ml；
3.Caspase-1 mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
Caspase-1的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關(guān)，應(yīng)重新處理標本。

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ZN0339 CTNNAL1 mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN0458 EP3 mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN0533 FOXN4 mRNA原位雜交試劑盒 100T

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