腸出血性大腸桿菌致賀毒素2由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于生化實驗研究等領域，我公司專注于細菌PCR檢測試劑盒產品的研發、生產和供應，為您提供的腸出血性大腸桿菌致賀毒素2質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括腸出血性大腸桿菌致賀毒素2(Stx2)單重熒光PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：腸出血性大腸桿菌致賀毒素2(Stx2)單重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA085
產品規格：48次/盒



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一、簡介：
本試劑盒用一對金黃色葡萄球菌腸毒素B特異性引物，對金黃色葡萄球菌腸毒素B DNA進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

二、用途：
該試劑盒適合于檢測水樣糞便、疑似污染物的水、食物等樣本中的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)，用于金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的輔助診斷，其檢測結果僅供臨床參考。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數量 規格
金黃色葡萄球菌PCR反應液(SEB-PCR MIX) 1管 672μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
腸毒素B陽性對照(SEB-PTC 107copies/μL) 1管 50μL/管
腸毒素B陽性對照(SEB-PTC 106copies/μL) 1管 50μL/管
腸毒素B陽性對照(SEB-PTC 105copies/μL) 1管 50μL/管
腸毒素B陽性對照(SEB-PTC 104copies/μL) 1管 50μL/管
腸毒素B陽性對照(SEB-PTC 103copies/μL) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個月。

五、PCR儀器適用范圍
ABI系列，Roche系列等PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與DNA提取
6.1 樣品的采集
6.1.1 食品樣品：樣品的采集與預培養按照樣品的采集與預培養按照《食品安家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》(GB 4789.10-2010)要求進行。
6.1.2 糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
6.1.3 病灶部位樣品：取發病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
 注：上述樣品建議經過增菌后，收集培養物用于檢測。
6.2 DNA提取
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購北京百奧萊博科技有限公司生產的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
6.2.1液體培養物：取液體培養物100μL加到1.5mL無菌離心管中，8000rpm離心3min，盡量吸棄上清，加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
6.2.2固體培養物：挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
6.2.3 糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
6.2.4 其他液體標本：取標本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
 注：建議采用相關標準方法進行前增菌，并按照6.2.1方法進行提取。陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qPCR反應液(SEB-qPCR MIX)、酶混合液(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合液 1μL N×1μL
總量 15μL N×15μL
向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(SEB-PTC103、104、105、106、107copies/μL)5μL(建議由低濃度向高濃度順序加入反應液，避免高濃度陽性對照品污染反應液)，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM，淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

八、結果分析：
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
（1） 陰性對照(NTC)：不應產生任何的擴增曲線。
（2） 陽性對照(SEB-PTC)：均產生擴增曲線。
（3） 以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
（1） 在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明SEB核酸陽性。
（2） Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明SEB核酸陰性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
（4） 對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行SEB qPCR檢測。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明SEB核酸陽性；否則判為樣本陰性。
（5） 標準曲線相關系數數值介于0.97~1之間。(相關系數數值等同于r2值)，根據斜率及Y軸截距列出計算公式，并通過標準曲線計算樣品RNA含量拷貝數。
例如：Y軸截距=41.5 斜率=-3.83
公式為：Y=-3.83(logX)+41.5

九、注意事項：
（1） 初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
（2） 所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA酶。
（3） PCR操作應嚴格按照要求分區(試劑配制區、標本處理區、PCR擴增區等)，防止實驗室污染。
（4） 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區的超凈工作臺進行，以免污染。
（5） 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。


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