大腸埃希氏菌是高品質的細菌PCR檢測試劑盒產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于生化實驗研究等領域，大腸埃希氏菌是我司眾多優質細菌PCR檢測試劑盒之一，質量堪比同類進口產品，價格非常優惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括大腸埃希氏菌(O157:H7)熒光定量PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：大腸埃希氏菌(O157:H7)熒光定量PCR檢測試劑盒
英文名稱：Escherichia coli O157:H7 qPCR Kit
產品貨號：BTN11-710
產品規格：50次

大腸埃希氏菌，俗稱大腸桿菌（Escherichia coli），屬于革蘭氏陰性細菌。大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的zuì常見類型，O表示抗原類型, H7表示血清型。其感染劑量低，人體只要攝入10個細菌就可以致病，目前還沒有疫苗，因此大量開展預防檢測工作具有重要的意義。目前對O157的檢測主要是傳統分離培養、免疫學和分子水平的 PCR 檢測。本試劑盒就是利用實時熒光定量 PCR技術開發的大腸桿菌 O157:H7檢測試劑盒，它通過熒光染料實時顯示樣品模板DNA的量，并通過坐標曲線表示出來，結果直觀準確。

產品特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準確快速。
2. 熒光定量PCR檢測，反應特異性強。
3. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

產品組成：

組分	編號	規格(50T)
2×qPCR Mix	BTN90408	1mL
O157:H7專一性引物對	yw13851386	200 μL
O157:H7陽性對照，XXX 10E9拷貝/μL	yw13871388	100 μL
超純水	BTN100935	1mL

保存條件：-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：樣品等

使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備O157:H7標準曲線（以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（zuì好用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標準品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對照。
5. 換槍頭，從6號管中取5 μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對照。
6. 換槍頭，從5號管中取5 μL溶液到4號管中，重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。
7. NC管中不加任何陽性對照。
8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進行定量PCR（見下步），每個樣品做3次重復。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數值為橫軸，繪制標準曲線。
三、PCR檢測（20μL體系）
1. 在PCR管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復，下表只列出一次）：

成份	樣品	陰性對照	陽性對照
2×qPCR Mix	10 μL	10 μL	10 μL
待測樣品DNA模板	1-5 μL	無	無
O157:H7陽性對照， XXX 10E9拷貝/μL	無	無	5uL(每個管加一個 稀釋度的對照)
自備10×ROX (見注)	2 μL	2 μL	2 μL
O157:H7專一性引物對	2 μL	2 μL	2 μL
補水到	20 μL

注：僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX。
2. 建議PCR反應參數（具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化）

過程	溫度	時間
預變性	95℃	10分鐘
PCR反應 (40個循環)	94℃	15s
	60℃	30s

3. 數據采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時，zuì大吸收光譜在471 nm，結合DNA時的zuì大吸收光譜在500 nm，zuì大發射光譜在530 nm。

四、數據處理
以O157:H7陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品濃度的log為橫軸，以Ct值為縱軸，通過待測樣品的Ct值計算出樣品DNA的濃度。

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