DNA末端修復/加dA尾試劑（I是高品質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于生化實驗研究等領(lǐng)域，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價位合理，需要DNA末端修復/加dA尾試劑（I等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的客戶，請到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括DNA末端修復/加dA尾試劑（Illumina)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：DNA末端修復/加dA尾試劑（Illumina)
英文名稱：End Repair/dA-Tailing Reagent（Illumina)
產(chǎn)品貨號：WH0209
產(chǎn)品規(guī)格：24次|96次

本制品是專門針對于illumina高通量測序平臺文庫構(gòu)建所優(yōu)化預(yù)混酶模塊，能夠?qū)Τ曁幚怼⒒瘜W處理、酶處理的片段化雙鏈DNA或小片段DNA的末端進行修復，使DNA雙鏈形成平末端，并分別在片段化DNA兩端添加5"-P和3"端dA，所得產(chǎn)物無需純化，直接用于Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）進行DNA片段的adapter連接。本試劑盒采用一步法反應(yīng)流程，省去了多步純化步驟，可對低DNA樣本進行、快速末端修復及dA尾添加，操作更加簡便，文庫轉(zhuǎn)化效率更高。

產(chǎn)品特點：
·單管酶促反應(yīng)，一步完成雙鏈DNA片段的末端修復、dA添加反應(yīng)。
·高文庫轉(zhuǎn)化效率，DNA樣本其實量可低至0.25ng。

產(chǎn)品組成：

組分	24次	96次
5×ERA Enzyme Mix	240μl	960 μl
10×ERA Buffer	120 μl	480 μl
Nuclease-Free ddH2O	1ml	4×1ml

保存條件：-25~-15℃保存，避免反復凍融，保質(zhì)期為一年。

注意事項：（請務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項）
1．操作過程請注意避免核酸樣品和產(chǎn)物之間的交叉污染。
2．請使用不含RNA酶或DNA酶的槍頭、EP管進行試驗。
3．試驗開始前，請清潔操作臺，確保沒有RNA酶和DNA酶的污染。
4．進行文庫擴增前，請確保PCR儀已經(jīng)調(diào)試好并處于穩(wěn)定的狀態(tài)。
5．試驗前請仔細閱讀說明書，如果需要暫停試驗，或者無需立即進行下游試驗。可根據(jù)說明書推薦將試驗產(chǎn)物保存于-20℃并安排后續(xù)試驗。

推薦使用的其他試劑：
1.Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）
2.Single-Indexed Adapter （Illumina Platforms)（WH0206-01/02/03）
3.NGS Library Amplification Reagent（WH0210-01/02）

操作步驟：

準備開始實驗前，了解樣本DNA的濃度及Buffer成分至關(guān)重要，推薦上樣量0.25ng~1μg DNA。我們推薦DNA溶解于以下溶液中：去離子水、Buffer EB或LoTE（0.1×TE）。
1．將10×ERA Buffer和5×ERA Enzyme Mix置于冰上融化，短暫混勻。
2．按下表設(shè)置PCR儀程序，熱蓋溫度設(shè)置為70℃。

操作步驟	溫度	時間
1	4℃	1min
2	20℃	30min
3	65℃	30min
4	4℃	保持溫度

3．取1個的200 μl薄壁管，按下表在冰上配置反應(yīng)體系。

成分	用量
10×ERA buffer	5 μl
DNA sample	X μl
Nuclease-Free ddH2O	（35-X) μl
Total	40 μl

4.向步驟3的薄壁管中加入10 μl 5×ERA Enzyme Mix，輕柔吸打6-8次混勻，注意不要渦旋。
  注：此步驟需要保持在冰浴中進行。
5.將配置好反應(yīng)體系的薄壁管放入4℃預(yù)冷的PCR儀中，并開啟步驟2中的程序。
6.當反應(yīng)程序結(jié)束后，將薄壁管從PCR儀中取出并置冰上。
7.立即進入接頭連接步驟，為保證連接效率，推薦使用Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）。

根據(jù)您的關(guān)注的DNA末端修復/加dA尾試劑（Illumina)，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：



名稱：DNA文庫定量試劑盒(Ion Torrent平臺)
貨號：WE0233
規(guī)格：1ml|5ml
  本產(chǎn)品是采用染料法(SYBR Green I)對NGS建庫后的產(chǎn)物進行實時熒光定量PCR(qPCR)。試劑盒提供了qPCR過程所需的反應(yīng)混合液，DNA引物混合物、標準品以及樣品稀釋液，試劑體系完整，操作簡單方便。反應(yīng)混合物中所含的熒光染料SYBR Green I 可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合；使用的BaldStar Taq DNA Polymerase是一種經(jīng)化學修飾的全新熱啟動聚合酶，酶的激活需在95℃下孵育10 min。該產(chǎn)品特異性強、擴增效率高，能夠?qū)?gòu)建的文庫濃度進行快速準確的定量。
  ROX染料用于校正定量PCR儀孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR擴增儀。不同儀器的激發(fā)光學系統(tǒng)有所不同，因此ROX染料的濃度必須與相應(yīng)的熒光定量PCR儀相匹配。
  不需要ROX校正的儀器： Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-radiCyler iQ，iQ5，CFX96等。
  需要Low ROX校正的儀器： ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System， QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system， Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
  需要High ROX校正的儀器： ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

名稱：Bcl-X/L mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0125
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.Bcl-X/L mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
Bcl-X/L的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時，用預(yù)雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關(guān)，應(yīng)重新處理標本。

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貨號	名稱	規(guī)格
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ZN0094	ASIC 1a mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0231	CCR7 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0491	FAF1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0517	FHIT mRNA原位雜交試劑盒	100T

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