我公司致力于為客戶提供高純度、低成本的活性重組蛋白，包括鏈cDNA合成試劑盒在內(nèi)的各類受體、細(xì)胞因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...

特別提示：包括鏈cDNA合成試劑盒(預(yù)混試劑)(去除基因組DNA)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：鏈cDNA合成試劑盒(預(yù)混試劑)(去除基因組DNA)
英文名稱：Balbscript PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix
產(chǎn)品貨號：JN0005
產(chǎn)品規(guī)格：50次|100次

  本試劑盒是以mRNA或者總RNA為模板，合成鏈cDNA。本產(chǎn)品含有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的全部試劑（Balbscript Reverse Transcriptase，RNase Inhibitor，Oligo(dT)18，Random N6，dNTPs），濃度為2×。反應(yīng)時只需要加入RNA模板和水即可，操作簡單，降低操作過程中的污染。本制品含有去除基因組的成分gDNA Purge，可以同步去除基因組DNA污染。反應(yīng)結(jié)束后，85℃加熱5秒鐘，就可以失活反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑以及gDNA Purge。合成的鏈cDNA能直接用于PCR或熒光定量PCR的模板以及第二鏈cDNA的合成或線性RNA擴增的模板，也可用于帶有放射性或非放射性核苷酸標(biāo)記鏈cDNA的實驗。

試劑盒組成：

組份	JN0005-50次
2×BalbscriptR PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix	500μl
gDNA Purge	50μl
RNase Free Water	1ml

注意事項：
1、用DEPC處理實驗用到的所有器材，或者購買已經(jīng)證明無核酸酶的實驗用具，整個實驗過程需戴手套并經(jīng)常更換手套，避免RNA酶的污染。
2、確保所用試劑中無RNA酶污染。
3、試劑盒如不使用，要嚴(yán)格密封保存。在反轉(zhuǎn)錄過程中，所有管蓋要確保扣嚴(yán)。
4、純化過的RNA要保證不含有鹽，金屬離子，乙醇和苯酚，因為以上成分會干擾鏈cDNA的合成反應(yīng)。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。

實驗步驟：

鏈cDNA合成:
1、融化后，將試劑盒中各組分混勻并稍微離心后置于冰上。
2、按順序加入下面的反應(yīng)物

模板RNA	總RNA(0.1 ng -5μg) poly(A) mRNA(10 pg) 特異性RNA(0.01 pg)
2×Balbscript PreMix UltraMix	10μl
gDNA Purge	1μl
RNase Free Water	至20μl

3、可選優(yōu)化步驟。如果RNA模板GC含量高或者含有二級結(jié)構(gòu)，可先將RNA模板和RNase Free Water混勻后，65℃孵育5分鐘，冰上冷卻后再加入其它組分。
4、輕柔混勻后離心，于42℃條件下孵育60分鐘。 如果RNA模板中不含poly A結(jié)構(gòu)，可先在25℃條件下孵育5分鐘，隨后轉(zhuǎn)到42℃條件下孵育60分鐘。
5、70℃加熱5min終止反應(yīng)。
反應(yīng)產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)，如果不立即使用，在-20℃可保存一周左右。如想延長保存時間，建議使用-70℃保存。

鏈cDNA的PCR擴增:
合成的鏈cDNA可直接用于PCR或qPCR。鏈cDNA反應(yīng)液體積不能超過PCR反應(yīng)體系的1/10。通常50 μl的PCR反應(yīng)體系中，鏈cDNA反應(yīng)液加入2μl。

儲存條件：-20℃

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名稱：Pfu DNA Polymerase
貨號：WE0107
規(guī)格：500U
  Pfu DNA Polymerase是通過大腸桿菌表達(dá)純化的重組酶，具有5"-3"DNA聚合酶活性和5"-3"外切核酸酶活性的同時具有3"-5"外切核酸酶活性，因此在DNA擴增過程中具有糾錯能力，是目前發(fā)現(xiàn)的錯配率zuì低的耐高溫DNA Polymerase。該酶與Taq DNA Polymerase相比具有更好的熱穩(wěn)定性，對于高GC含量模板，提高變性溫度對它活性無影響。使用本產(chǎn)品擴增得到的PCR產(chǎn)物的3"端不帶有“A”堿基，不能直接用于T/A克隆，如需進(jìn)行T/A克隆則需要在其末端添加“A”或用平末端載體進(jìn)行克隆。本產(chǎn)品適用于基因克隆、基因定點突變、SNP和末端補平等實驗。

產(chǎn)品組成：

組份	500U
Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl	100μl
10×PCR Buffer	1.8ml

注意：本產(chǎn)品的10×PCR Buffer中含有15 mM鎂離子。

活性定義：
用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在74℃，30分鐘內(nèi)，將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸性不溶物質(zhì)所需的酶量定義為1個活性單位(U)。

質(zhì)量控制：
1、經(jīng)過多次柱純化，SDS-PAGE檢測其純度大于99%；
2、經(jīng)檢測無外源核酸酶活性；
3、PCR方法檢測無宿主殘余DNA；
4、能有效地擴增人基因組中的單拷貝基因；
5、室溫存放一個月，無明顯活性改變。

使用方法：
以下舉例為以人基因組DNA為模板，擴增1 kb的片段的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。

1、PCR反應(yīng)體系

試劑	50μl反應(yīng)體系	終濃度
10×PCR Buffer	5μl	1×
dNTP Mix，10 mM each	1μl	200μM each
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl	0.5μl	2.5 U/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)用Pfu酶擴增時，引物的純度要求較高，引物長度大于18個堿基，引物濃度請以終濃度0.1-1.0μM作為設(shè)定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2)Pfu酶3"-5"外切酶活性可能降解引物，所以應(yīng)先加dNTP后，再加Pfu酶到反應(yīng)體系中，并立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2、PCR反應(yīng)條件

步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	94℃	2 min
變性	94℃	30 s	25-35 個循環(huán)
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	60 s
終延伸	72℃	5 min

注意：
1)Pfu酶的熱穩(wěn)定性比Taq酶好，對于GC含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃，對Pfu酶的活性無影響。
2)一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
3)Pfu酶具有3"-5"外切酶活性，所以Pfu酶擴增時延伸速度遠(yuǎn)比Taq酶低，延伸時間根據(jù)所擴增片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品的擴增延伸速率為1 kb/min。
4)可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
5)本產(chǎn)品具有3"-5"外切核酸酶活性，PCR產(chǎn)物3’端不帶“A”,不能直接用于T/A克隆，如需進(jìn)行T/A克隆則需要在其末端添加“A”或用平末端載體進(jìn)行克隆。

儲存條件：-20℃，避免反復(fù)凍融。

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