酵母內質網提取試劑盒（低速離心法）只需要達到20000×g以內的離心力即可提取內質網，一般的常規臺式離心機均可以滿足使用要求。酵母內質網提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種酵母樣品中提取總內質網。提取過程簡單方便。本試劑盒不能用于冷凍樣品的內質網提取。...

酵母內質網提取試劑盒(低速離心法)

 

產品編號：HR9110

產品組成：

儲存條件：

2-8℃保存，有效期1年。

【注】：

● 酵母內質網提取液B、酵母洗滌液D長期不用時-20℃保存。避免反復凍融。

產品簡介：

傳統的內質網提取方法需要采用較高的離心力或者采用密度梯度離心，對實驗室離心機設備要求較高，對實驗的操作細致程度要求較高。如果實驗室沒有能達到50000×g以上的離心力的設備，則沒法進行提取。

酵母內質網提取試劑盒（低速離心法）只需要達到20000×g以內的離心力即可提取內質網，一般的常規臺式離心機均可以滿足使用要求。

酵母內質網提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種酵母樣品中提取總內質網。提取過程簡單方便。

本試劑盒不能用于冷凍樣品的內質網提取。

酵母內質網提取試劑盒(低速離心法)試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 離心機 ● 振蕩器 ● 移液器 ● 勻漿機/勻漿器 ● 渦旋混勻器 ● PBS ● 蛋白定量試劑盒

使用注意事項：

● 預實驗很重要。必須要做預實驗，在正式實驗之前取少量樣本優化實驗條件，并像正式樣本一樣認真進行，看實驗結果是否可行，實驗條件是否適合自己的樣本。由于生物樣本的多樣性，不同樣本的實驗條件通常差異較大，同種細胞的不同模型下需要的實驗條件也可能不同，為了避免浪費正式樣本和試劑，一定要提前預實驗優化實驗條件。

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

● 如果是做核酸類下游應用，實驗中所有液體以及器具均應該用DEPC 處理。用0.1%的DEPC處理12小時然后高壓。

● 下游用于蛋白質類實驗的話可以不用DEPC處理。

● 細胞最好采用新鮮收集的，或者收集后立即置于-80℃保存的樣本。

● 最好使用標準Dounce勻漿器勻漿，如果沒有標準Dounce勻漿器，用普通玻璃勻漿器勻漿也可，但是內質網回收率可能會下降。

● 離心機轉速有相對離心力（RCF，×g）和每分鐘轉速（RPM，r/min）兩種表示方式，有些離心機設置有RPM和×g顯示切換，但部分離心機沒有自動切換功能。需要用下面的公式進行換算：

g=r×1.118×10^-5×rpm²（r為有效離心半徑，即從離心機軸心到離心收集管底部中心位置的長度，單位為厘米) 例如：轉速為3000rpm，有效離心半徑為10cm，則相對離心力（RCF，×g）為=10×1.118×10^-5×3000²=1006.2（×g）。

使用方法：

1、酵母培養物，在4℃，1000×g條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集酵母沉淀。

2、用PBS洗滌酵母兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

【注】：

● 在1000×g離心5 分鐘。

3、每100μL體積或100 mg 濕重酵母沉淀物中加入400μL酵母內質網提取液A，混勻后，在30℃條件下保溫15分鐘。

【注】：

● 酵母數量根據實驗情況調整，每次的裂解液用量并不是一定的，請根據實際情況調整。

4、在1000×g條件下離心5-10分鐘，收集酵母沉淀。

5、用300μL酵母洗滌液D重懸細胞，靜置10分鐘，離心收集酵母。

6、酵母沉淀物中加入500μL酵母內質網提取液B，充分混勻。

【注】：

● 根據酵母細胞量調整提取液用量，一般加菌體體積的2-5倍均可。

● 按酵母菌體體積每100μL或100mg濕重菌體加入250-500μL提取液。

7、在37℃或室溫條件下輕微振蕩60-90分鐘。

【注】：

● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔10分鐘用移液器吹打混勻。

● 不同酵母樣本需要的時間差異較大，根據下游細胞裂解的難易程度調整，如果下游試劑C處理后沉淀沒有明顯減少，需要延長此步驟處理時間?？梢匝娱L至2小時。

8、在2000×g條件下離心5-10分鐘，棄上清，收集沉淀。

9、沉淀用300μL酵母洗滌液D洗滌兩次。離心收集沉淀。

10、在沉淀中加入400μL酵母內質網提取液C，充分混勻，用Dounce勻漿器勻漿20-30下。

【注】：

● 標準Dounce勻漿器用緊杵5-8次，松杵勻漿15-20次。

● 勻漿杵一個上下來回為一次。

● 普通玻璃勻漿器勻漿一般也不超過30次，勻漿次數并非越多越好。

● 如果沒有勻漿器，可以在加入試劑C以后在振蕩器上振蕩10-30分鐘。用振蕩器/搖床的較低轉速，保持提取液有輕微晃動即可。沒有振蕩器的話，在4℃靜置，稍微延長處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

● 試劑C處理后沉淀應減少，否則振蕩延長處理時間。

11、將勻漿液在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。

12、將上清在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘，棄沉淀，收集上清。

13、將上清在4℃，12000×g-20000×g力條件下離心10分鐘。棄沉淀，收集上清。

14、在上清中加入100μL試劑E，充分混勻。

15、置2-8℃冰箱靜置過夜。

【注】：

● 靜置保存時間不少于10小時。

16、在4℃條件下，10000×g離心20-45分鐘。

17、小心移除上清，收集沉淀。

【注】：

● 盡可能吸干上清。

● 吸取時小心，防止吸掉沉淀。

18、沉淀用適量內質網保存液或其他相應的緩沖液重懸。即得到酵母內質網樣品。

【注】：

● 也可不用試劑盒中內質網保存液重懸，據實驗需要選擇合適的緩沖液重懸內質網或直接用于下游實驗。

19、置冰箱備用或直接用于下游實驗。酵母內質網提取試劑盒(低速離心法)

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