線粒體膜蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種原代或傳代細胞和各種實體組織，如腦、脊髓、神經結或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結締組織等哺乳動物組織中提取線粒體膜蛋白。...

線粒體膜蛋白提取試劑盒

 

產品編號：HR0111

產品組成：

儲存條件：

蛋白提取液、溶解液2-8℃保存；蛋白酶抑制劑-20℃保存，有效期1年。

【注】：

● 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可2-8℃保存，開蓋使用后-20℃保存。

● 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

產品簡介：

線粒體膜蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種原代或傳代細胞和各種實體組織，如腦、脊髓、神經結或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結締組織等哺乳動物組織中提取線粒體膜蛋白。

本試劑盒含有的獨特配方能夠有效溶解線粒體膜組分。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。

線粒體膜蛋白提取試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質電泳、免疫沉淀、ELISA、轉錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實驗、酶活性測定等蛋白研究。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構象的活性蛋白。

本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯合層析等下游應用兼容。

本試劑盒提取的蛋白樣本含有高濃度的鹽成分，不可直接用于2D電泳，如下游實驗需要直接用于等電聚焦、雙向電泳，請使用其他貨號的試劑盒。也可以將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，用脫鹽柱脫鹽處理。

產品特點：

● 使用方便，從細胞，組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。

● 將蛋白提取的時間縮短至1小時。

● 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。

● 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含7 種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 移液器 ● 離心機 ● 渦旋振蕩器 ● Dounce勻漿器 ● PBS

● 蛋白定量試劑盒

使用注意事項：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 最好使用標準Dounce勻漿器勻漿，如果沒有標準Dounce勻漿器，用普通玻璃勻漿器勻漿也可，但是線粒體膜蛋白回收率可能會下降。

● 最好用新鮮的細胞/組織樣本，也可以用凍存的細胞/組織樣本，但是線粒體膜蛋白回收率會下降。

● 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

● 提取液C在使用前需一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。

● 膜蛋白電泳時Loading Buffer應該避免煮沸。

● 膜蛋白電泳時可以提高Loading Buffer的SDS含量。

線粒體膜蛋白提取試劑盒使用方法：

細胞樣本：

1、提取液準備：

每200μL冷的蛋白提取液C中加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每200μL冷的組分D中加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

● 提取液C在使用前需一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、取2×10⁷個細胞，在4℃，500×g條件下離心5分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞。貼壁細胞胰酶消化或直接刮下進行相應洗滌即可。

【注】：

● 由于線粒體膜蛋白含量極少，需要較多的細胞才能保證得率。在條件允許的情況下，盡可能加大細胞上樣量。

3、用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4、加入400μL冷的組分A，置4℃條件下持續輕微振蕩5-15分鐘。用Dounce勻漿器充分勻漿20-30次。

【注】：

● 用Dounce勻漿器勻漿至細胞充分破碎，無明顯可見固體。

● 標準Dounce勻漿器用緊杵5-8次，松杵勻漿15-20次。

● 每上下一個來回為一次。

● 沒有Dounce勻漿器也可用普通玻璃勻漿器或勻漿機勻漿。

● 普通玻璃勻漿器勻漿一般也不超過30次，勻漿次數并非越多越好。

5、然后在4℃，500×g條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。

【注】：

● 組分A處理后，細胞沉淀體積應明顯減少。

6、將上清吸入另一預冷的干凈離心管。

7、在4℃，11000×g以上條件下離心20分鐘。棄上清，留沉淀。

8、在沉淀中加入200μL冷的組分B，混勻。

9、在4℃，11000×g以上條件下離心20分鐘。棄上清，留沉淀。

10、在沉淀中加入200μL冷的組分C，高速渦旋振蕩15秒，置4℃條件下持續振蕩15-30分鐘。

【注】：

● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。

● 此步驟必須在4℃條件處理。

● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

● 提取液C在使用前需一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。

11、在37℃水浴/氣浴10分鐘。

12、在37℃條件下1000-2000×g離心5分鐘，此時溶液分為兩層（對著光線看），下層約為20-40μL。

【注】：

● 必需保證在37℃左右下離心，至少確保30℃以上。

● 無可控溫的離心機時，也可以不離心，稍微延長37℃水浴/氣浴時間，至液體澄清，分層清晰即可。

● 進行下游實驗時，可以用組分D分別稀釋上層和下層，取一個上層樣品同時進行實驗分析。

13、小心吸取上層丟棄，留下下層溶液。

【注】：

● 移除上層時沿著管壁液面小心吸取，不要攪動下層。

● 下層為粘稠狀液體。

14、用50-100μL冰冷的膜蛋白溶解液溶解下層，即得線粒體膜蛋白。

【注】：

● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置至溶解。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。

● 于4℃靜置直至管底透明膠狀物完全溶解。

15、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。

【注】：

● 建議用BCA法進行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題，注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

組織樣本：
1、提取液準備：

每200μL冷的蛋白提取液C中加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每200μL冷的組分D中加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

● 提取液C在使用前需一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、取100mg左右的組織樣本，用手術剪刀將組織盡可能剪碎，用PBS緩沖液或生理鹽水洗滌干凈。

【注】：

● 由于線粒體膜蛋白含量極少，在條件允許的情況下，需要較多的樣本才能保證得率。

3、加入適量PBS（或400μL冷的組分A），用Dounce勻漿器充分勻漿20-30次。

● 用Dounce勻漿器勻漿至組織充分破碎，無明顯可見固體。

● 標準Dounce勻漿器用緊杵5-8次，松杵勻漿15-20次。

● 每上下一個來回為一次。

● 沒有Dounce勻漿器也可用普通玻璃勻漿器或勻漿機勻漿。

● 普通玻璃勻漿器勻漿一般也不超過30次，勻漿次數并非越多越好。

4、然后將勻漿液在4℃，500×g條件下離心5分鐘。

5、棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。

6、將上清在4℃，1000×g條件下離心10分鐘。棄沉淀，收集上清。

7、在4℃，11000×g以上條件下離心20分鐘。棄上清，收集沉淀。

8、在沉淀中加入200μL冷的組分B，充分混勻。

9、在4℃，11000×g以上條件下離心20分鐘。棄上清，收集沉淀。

10、在沉淀中加入200μL冷的組分C，高速渦旋混勻5秒，置4℃條件下持續振蕩20-30分鐘。

【注】：

● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。

● 此步驟必須在4℃條件處理。

● 沒有振蕩器時，在4℃靜置，稍微延長時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

● 提取液C在使用前需一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。

11、在37℃水浴/氣浴10分鐘。

12、在37℃條件下1000×g離心5分鐘，此時溶液分為兩層，下層約為20-40μL。

【注】：

● 必需保證在37℃左右下離心，至少確保30℃以上。

● 無可控溫的離心機時，也可以不離心，稍微延長37℃水浴/氣浴時間，至液體澄清，分層清晰即可。

13、小心吸取上層丟棄，留下下層溶液。

【注】：

● 移除上層時沿著管壁液面小心吸取，不要攪動下層。

● 下層為粘稠狀液體。

14、用50-100μL冰冷的膜蛋白溶解液溶解下層，即得線粒體膜蛋白。

【注】：

● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置至溶解。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。

● 于4℃靜置直至管底透明膠狀物完全溶解。

15、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。

【注】：

● 建議用BCA法進行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題，注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

常見問題分析：

● 蛋白濃度低？

處理部分組織樣本時可能沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑A和C的處理時間即可。最好在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

粒體膜蛋白豐度極低，在條件允許的情況下，需要盡可能加大酵母細胞的上樣量，才能收獲足夠的膜蛋白。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑D中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。

● 膜蛋白電泳沒有條帶？

膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。

膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超聲處理一下，再進行蛋白定量。

蛋白加Loading Buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。

蛋白Loading Buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。

有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。

電泳時最好采用低電壓低電流電泳。

膜蛋白豐度通常較低，有條件可以嘗試用銀染染色。

 

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