在激發波長535nm,發射波長610nm附近,使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀等檢測熒光,從而測定細胞內活性氧水平。...

活性氧檢測試劑盒(DHE,紅色熒光)

 

產品編號：HR8685

產品組成：

儲存條件：

-20℃避光保存，避免反復凍融；有效期6個月。

活性氧檢測試劑盒(DHE,紅色熒光)【注】：

● DHE熒光探針為DMSO溶液,冬季氣溫較低時為凝固狀態,極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解,變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

● 可用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需放培養箱預熱,否則易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

產品簡介：

活性氧檢測試劑盒(DHE,紅色熒光)是一種利用熒光探針DHE進行活性氧檢測的試劑盒。DHE可自由透過活細胞膜進入細胞內,并被細胞內的ROS氧化,形成氧化乙啶；氧化乙啶可摻入染色體DNA中,產生紅色熒光。根據活細胞中紅色熒光的產生,可以判斷細胞ROS含量的多少和變化。二氫乙啶在細胞內主要被超氧陰離子型ROS氧化,用流式細胞儀或熒光顯微鏡可直接觀察,是一種快速簡便的細胞中ROS經典檢測方法。

在激發波長535nm,發射波長610nm附近,使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀等檢測熒光,從而測定細胞內活性氧水平。

產品特點：

● 使用方便； ● 背景低,靈敏度高； ● 線性范圍寬,使用方便。

檢測方法：

● 流式細胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

活性氧檢測試劑盒(DHE,紅色熒光)樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計或熒光酶標儀或流式細胞儀，激發波長535nm,發射波長610nm。

● 離心機 ● 移液器 ● PBS緩沖液/HBSS（不含酚紅）

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。

● 熒光探針標記后,一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針,否則會導致背景較高。

● 探針標記完畢并洗凈殘余探針后,可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描,以確認探針的標記情況是否正常。

● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間,以減少各種可能的誤差。

● 對于藥物作用時間較短(2小時以內)的細胞,先標記探針,后用藥物刺激細胞。對于藥物作用時間較長(6小時以上)的細胞,先用活性氧陽性對照誘導劑或相應的藥物刺激細胞,后標記探針。

● DHE在光照和空氣中易被氧化,注意避光密封保存。

● 對不同的細胞,應選擇合適的孵育時間和濃度,以觀察ROS的變化。

使用方法：

DHE探針配制：

DHE探針可在新鮮無血清培養基、各種緩沖鹽溶液中稀釋到所需濃度，1000-10000倍稀釋,以此染色液更換細胞培養基；也可直接向細胞培養基中加入DHE探針溶液至所需濃度。

【注】：

● 開始實驗前,使用HBSS緩沖液或無血清培養基稀釋染料儲存液到需要的工作濃度。工作濃度應根據不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度,建議至少在超過10倍范圍的濃度下進行測試。一般染色終濃度1000-10000倍稀釋,1000-2000倍適合大多數細胞樣本。

● 建議收到產品后,根據單次使用量,對母液進行小量分裝,每次使用一管,試劑-20℃避光凍存,一年穩定。

● 工作液現用現配。

2、依據細胞ROS含量的不同,DHE終濃度可選擇在1000-10000倍稀釋的范圍,孵育時間可選擇10-90分鐘,在37℃或室溫進行避光孵育。

DHE探針標記：

原位標記：僅適用于貼壁培養細胞。

1、按照1:1000-2000用無血清培養基稀釋DHE探針。

【注】：

● 不能用含有血清的培養基稀釋DHE探針。

● 也可以用HBSS緩沖液稀釋探針。

2、去除細胞培養基,用PBS洗細胞一次。

3、加入適當體積稀釋好的DHE探針。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜,通常對于96孔板每孔加入100-200μL染色液；六孔板的一個孔加入稀釋好的DHE探針不少于1mL。

4、在37℃細胞培養箱內避光孵育10-60分鐘。

5、用無血清細胞培養液洗滌細胞三次,以充分去除未進入細胞內的DHE探針。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗滌細胞。

收集后標記：懸浮細胞或貼壁細胞消化處理

1、按照1:1000用無血清培養基稀釋DHE探針。

【注】：

● 不能用含有血清的培養基稀釋DHE探針。

● 也可以用HBSS緩沖液稀釋探針。

1、離心移除培養基,用PBS洗細胞一次。

2、細胞收集后懸浮于稀釋好的DHE探針中,細胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/ml,37℃細胞培養箱內避光孵育10-60分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。

4、用無血清細胞培養液洗滌細胞三次,以充分去除未進入細胞內的DHE探針。

5、用無血清細胞培養基重懸細胞。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗滌細胞。

熒光顯微鏡檢測：

1、對貼壁生長細胞,可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細胞,取25-50μL細胞懸液滴到一張顯微載玻片上,再蓋上一張蓋玻片。

2、熒光顯微鏡下,用藍光/綠光激發,觀察和拍攝細胞紅色發射圖像,ROS陽性細胞在整個核區被染成紅色；用紫外光激發時,胞漿中未氧化的二氫乙啶可發出藍色熒光。

流式細胞儀分析：

1、對貼壁生長細胞,用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞,直接收集細胞。

用0.5～1ml冰冷PBS重懸細胞（5～10萬）。

2、采用480～535nm波長激發,測定590 nm～610nm以上的發射,細胞應可分成兩個亞群：ROS陰性細胞僅有很低的熒光強度,ROS陽性細胞有較強的紅色熒光。

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