F03細(xì)胞內(nèi)鈣離子染色試劑盒是利用F系列Ca2+鈣離子熒光探針進(jìn)行鈣離子特異性染色的試劑盒。本試劑盒中的F03細(xì)胞內(nèi)鈣離子染色探針為綠色熒光標(biāo)記的鈣離子探針,具有505/525nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長。...

Ca²⁺鈣離子染色試劑盒(F03綠色熒光)

 

產(chǎn)品編號：HR0612

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

染料-20℃避光保存，有效期6個月。

【注】：

● 染料短期2周內(nèi)可以2-8℃保存,長期不用可以-20℃保存,避免反復(fù)凍融。

● 染色液A為DMSO溶液,冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解,變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱,否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

Ca²⁺鈣離子染色試劑盒(F03綠色熒光)簡介：

F03細(xì)胞內(nèi)鈣離子染色試劑盒是利用F系列Ca²⁺鈣離子熒光探針進(jìn)行鈣離子特異性染色的試劑盒。本試劑盒中的F03細(xì)胞內(nèi)鈣離子染色探針為綠色熒光標(biāo)記的鈣離子探針,具有505/525nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長。

F03具有極高的細(xì)胞滲透性,經(jīng)過簡單孵育即可實現(xiàn)細(xì)胞加載。穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成不易透過細(xì)胞膜的F03新產(chǎn)物,從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。F03游離配體幾乎是非熒光性的,其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。但是,當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強的熒光,熒光會增加60至100倍,被激發(fā)后可以發(fā)出綠色的熒光,具有很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。最大激發(fā)波長為505nm,最大發(fā)射波長為525nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右,發(fā)射波長為515-530nm?？梢允褂脽晒怙@微鏡、酶標(biāo)儀、激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

F03熒光探針采用可見光激發(fā),與傳統(tǒng)的紫外光激發(fā)的熒光探針相比,儀器的適用范圍更廣泛,具有更強的探針吸收性能,使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca²⁺變化,從而降低了對活細(xì)胞的光毒性,檢測敏感度更高。

以96孔板每孔200μL染色液計,本試劑盒小包裝可以染色50-500個樣本。

檢測方法：

● 流式細(xì)胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦/流式細(xì)胞儀 ● 離心機(jī) ● 移液器 ● PBS ● HBSS

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝試劑開蓋前請短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。

● F03染色液為DMSO溶液,冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱,否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

● 用前,將本品取出回溫至室溫,并對其進(jìn)行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。

● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 染色后立即進(jìn)行分析。

● 本染色液可用于細(xì)胞涂片、細(xì)胞的檢測。

● F03探針在水中的穩(wěn)定性比較差,染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,并且在當(dāng)天用完。

● F03探針對濕度比較敏感,每次取完需要量后,必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量,分裝密閉保存。不可使用含水的吸頭。

● 試劑A母液請擰緊螺旋蓋,避免受潮失效。

● 可在染色溶液中加入等體積的20% Pluronic F127溶液（可選步驟）,Pluronic F127可以幫助F03更快進(jìn)入細(xì)胞,不建議在Pluronic F127中長期保存F03溶液。

● 標(biāo)記條件因細(xì)胞的種類而異,據(jù)不同樣本實際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整,每次正式實驗前先摸索一下細(xì)胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養(yǎng)時間等,找到最佳實驗條件。以下方法僅供參考。

Ca²⁺鈣離子染色試劑盒(F03綠色熒光)使用方法：

1、染色工作液的配制：

根據(jù)樣本數(shù)量,用37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱的HBSS將F03熒光染料200-1000倍稀釋,配制成染色工作液。

【注】：

● 也可以用相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基稀釋F03染料至所需濃度。

● 開始實驗前,使用HBSS緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋染料儲存液到需要的工作濃度。工作濃度應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實驗結(jié)果確定的最佳工作濃度,建議至少在超過10倍范圍的濃度下進(jìn)行測試。一般染色終濃度500-1000倍稀釋,500-1000倍適合大多數(shù)細(xì)胞樣本。

● 建議收到產(chǎn)品后,根據(jù)單次使用量,對母液進(jìn)行小量分裝,每次使用一管,試劑-20℃避光保存,一年穩(wěn)定。

● 工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用,避免反復(fù)凍存。

● 為了降低探針加載過度可能引起的假陽性,建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。

● 若細(xì)胞在染色后不含染料的培養(yǎng)基中孵育,熒光信號會衰減。

2、細(xì)胞染色

懸浮細(xì)胞染色

（1）用PBS洗滌細(xì)胞2次。

【注】：

● 500×g離心5分鐘。根據(jù)實驗室平時離心細(xì)胞的離心力離心。

（2）加入適量體積的染色工作液重懸細(xì)胞,使其密度大約為1×10⁶/mL。

（3）在37℃孵育細(xì)胞20分鐘,不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時間不同?？梢杂?0分鐘作為起始孵育時間,之后優(yōu)化體系以得到均一的標(biāo)記結(jié)果。

【注】：

● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。

（4）加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS,再繼續(xù)孵育40分鐘。

（5）孵育結(jié)束,500×g離心5分鐘。

【注】：

● 以下步驟均為洗滌細(xì)胞。根據(jù)實驗室平時離心細(xì)胞的離心力和時間進(jìn)行離心。

（6）棄上清液,再次緩慢加入37℃預(yù)熱的HBSS重懸細(xì)胞。

（7）重復(fù)（5）,（6）步驟兩次。

（8）加入HBSS重懸細(xì)胞,在37℃下再繼續(xù)孵育20分鐘。

（9）然后用該細(xì)胞進(jìn)行熒光鈣離子檢測。

貼壁細(xì)胞染色

（1）用PBS洗滌細(xì)胞2次。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)板中或細(xì)胞爬片上加入適量體積的染色工作液。

【注】：

● 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100μL染色液即可。

（3）37℃孵育細(xì)胞20-60分鐘,不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時間不同。可以用20分鐘作為起始孵育時間,之后優(yōu)化體系以得到均一的標(biāo)記結(jié)果。

【注】：

● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。

（4）吸干染色工作液,用HBSS洗培養(yǎng)板或蓋玻片2-3次,每次用預(yù)熱的HBSS覆蓋所有細(xì)胞,然后吸干培養(yǎng)基。

（5）加入HBSS,在37℃下再繼續(xù)孵育20分鐘。

（6）然后用該細(xì)胞進(jìn)行熒光鈣離子檢測。

3、用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測。

激發(fā)波長為488nm,最大發(fā)射波長為525nm。

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