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產品名稱：腸產毒性大腸桿菌(ETEC)單重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA088
產品規格：48次/盒



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本試劑盒適用于檢測糞便、水、血液等樣本肉毒桿菌(BL) A/B型DNA，用于肉毒桿菌(BL) A/B型感染的輔助診斷。其檢測結果僅供參考。
【原理】
本試劑盒用一對肉毒桿菌(BL)A/B型特異性引物和一條特異性熒光探針，經過裂解提取DNA，后者在Taq DNA聚合酶作用下，配以FQ-Buffer(內含Mg2+、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過PCR-熒光探針體外擴增法對肉毒桿菌(BL) A/B型DNA進行體外擴增，從而達到快速檢測肉毒桿菌(BL) A/B型之目的。
【組成】
名稱 數量 規格
核酸提取液 1管 2ml/管
Taq 酶系 1管 50μl/管
BL-A/B-qPCR MIX 1管 1000ml/管
BL-A/B -陽性質控品 1管 50μl/管
陰性質控品 1管 250μl/管
【儲存條件】-20℃保存，避免反復凍融。
【試劑規格及有效期】48T/盒，有效期6個月。
【適用儀器】
雙通道及以上PCR儀器。
【標本采集和保存與運輸】
1. 人或動物：
采集新鮮糞便，取黏液膿血部位標本，密閉送檢。
2．血液：
采集新鮮抗凝血(非肝素抗凝)，密閉送檢。
【使用方法】
1． DNA提取
1.1 糞便：挑取米粒大小糞便(盡可能取黏液膿血部分)，于放置有0.5ml生理鹽水的離心管中，振蕩混勻，13000rpm離心2分鐘。棄上清，沉淀中直接加入100μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10min，13000rpm離心5min取上清4μl做PCR反應。
1.2 水標本：取水樣3ml，13000rpm離心2min；棄上清，沉淀中直接加入100μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10min，13000rpm離心5min取上清4μl做PCR反應。
1.3 血液標本：取2ml抗凝血，靜置待自然分層，吸取上層（血漿層）及中層（Buffy coat層），13000rpm離心2分鐘。棄上清，沉淀中直接加入100μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10min，13000rpm離心5min取上清4μl做PCR反應。
2．PCR擴增
從試劑盒中取出BL-A/B-qPCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N（N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應體系配制如下表：
試劑 BL-A/B-qPCR MIX Taq酶系
用量 20μl 1μl
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入21μl，向每管中加入處理后樣品或BL-陽性質控品和陰性質控品4μl，10000rpm瞬時離心10秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，推薦循環條件:94℃→2分鐘，后94℃ 30秒→55℃ 45秒，40個循環。
熒光通道選擇：檢測選擇FAM通道和HEX/VIC/JOE通道。如果使用ABI系列儀器，請務必在passive reference和quencher處均選擇“NONE”。
3. 結果分析判定
FAM通道：Ct值≤35肉毒桿菌A型為陽性；Ct 值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重復試驗。重復試驗之后，如果Ct 值仍然在37-40個循環之間，判斷肉毒桿菌A型為陽性，沒有熒光值增長肉毒桿菌A型為陰性。
HEX/VIC/JOE通道：Ct值≤35肉毒桿菌B型為陽性；Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重復試驗。重復試驗之后，如果Ct值仍然在37-40個循環之間，判斷肉毒桿菌B型為陽性，沒有熒光值增長肉毒桿菌B型為陰性。
【質控標準】
陰性質控品：FAM和HEX/VIC/JOE通道全部陰性。
BL-陽性質控品：FAM和HEX/VIC/JOE通道的Ct值均應小于30.0。
以上條件應同時滿足 ，否則，此次試驗視為無效。
【注意事項】
初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
所有使用的離心管應高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
PCR操作應嚴格按照要求分區(試劑配制區、標本處理區、PCR擴增區等)，防止實驗室污染。
樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區的超凈工作臺進行，以免污染。
試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。


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