豬乙型腦炎病毒由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于科學研究，我公司的豬乙型腦炎病毒品質上佳，經過多年的開發生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括豬乙型腦炎病毒(JEV)單重熒光PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：豬乙型腦炎病毒(JEV)單重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA419
產品規格：48次/盒|96次/盒

一、簡介：
該方法采用一步法熒光qRT-PCR，反應在同一管內連續進行，操作簡單，并有效防止了污染，能對樣品中的豬乙型腦炎病毒進行快速檢測,具有特異性高、敏感性強和操作簡便的特點。

二、用途：
該試劑盒適合于檢測發病動物血液、腦脊液、組織以及病毒細胞培養液等標本中豬乙型腦炎病毒(JEV)RNA，適用于豬乙型腦炎病毒(JEV)感染的輔助診斷。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數量 規格
JEV熒光qRT-PCR反應液(JEV-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
陽性對照(JEV-PTC) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。
6、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
適用標本類型：發病動物的血液、體液、腦脊液、組織以及病毒培養物等標本。
6.1.1 組織：取發病組織約1g，置入1.5mL潔凈EP管，立即送檢。
6.1.2 血液、體液、腦脊液及病毒培養物：血液，無菌注射器抽取外周血1-2mL注入EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管；體液、腦脊液及病毒培養物液等，無菌條件下取0.5-1mL左右，置入1.5mL潔凈EP管，立即送檢。
6.2 RNA提取
可采購北京百奧萊博科技有限公司生產的RNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL 加入到反應體系中即可。
由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR 反應液(JEV-qRT-PCR MIX)，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm 離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照)，測試反應體系配制如下：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合液 1μL N×1μL
總量 15μL N×15μL
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm 離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL，向每管中加處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(JEV-PTC)5μL，10000rpm 瞬時離心10秒。
7.2 qRT-PCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
反轉錄(Reverse Transcription) 1循環 45℃ for 10 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

八、結果分析：
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
(1)陰性對照(NTC)： 不應產生任何的擴增曲線。
(2)陽性對照(JEV-PTC)：均產生擴增曲線。
(3)以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
(1)在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明JEV核酸陽性。
(2)Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明JEV核酸陰性。
(3)如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
(4)對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行JEV qRT-PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明JEV核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
(1)初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
(2)所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA 酶。
(3)PCR 操作應嚴格按照要求分區(試劑配制區、標本處理區、PCR 擴增區等)，防止實驗室污染。
(4)樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區的超凈工作臺進行，以免污染。
(5)試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。


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