產單核李斯特菌單重熒光PCR檢測的品牌是百奧萊博，是優質的細菌PCR檢測試劑盒產品，本制品僅用于生物化學研究方面，我公司專注于細菌PCR檢測試劑盒產品的研發、生產和供應，為您提供的產單核李斯特菌單重熒光PCR檢測質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括產單核李斯特菌單重熒光PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：產單核李斯特菌單重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA112
產品規格：48次/盒



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規格：48次/盒
本試劑盒適用于增菌培養物、疑似病料及食品中大腸桿菌O157(H7)的檢測，其檢測結果僅供參考。

出血性大腸桿菌EHEC O157(H7)可引起人的出血性腹瀉和腸炎的大腸埃希氏菌，引發人類、家畜以及野生禽獸不同形式的疾病。本方法為熒光PCR檢測方法，反應在同一管內連續進行，操作簡單，并有效防止了污染，能對樣品中或預培養液中的大腸桿菌 O157(H7)進行快速檢測，具有特異性高、敏感性強和操作簡便的特點。O157(H7)的探針報告基團為FAM，淬滅基團為None。

試劑盒組成：

組份	數量	規格
大腸桿菌 O157(H7)熒光qPCR反應液( O157(H7)-qPCR MIX)	1管	720μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
陰性對照(NTC)	1管	50μL/管
陽性對照(O157(H7-PTC)	1管	50μL/管

儲存條件：-20℃以下，有效期6個月。

使用方法：

一、樣品采集：
?食品樣品：樣品的采集與預培養按照《食品衛生微生物學檢驗大腸埃希氏菌 O157：H7/NM檢驗 (GB/T 4789.36-2008) 要求進行。
?糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
?病灶部位樣品：取發病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
 注：上述樣品建議經過增菌后，收集培養物用于檢測。

二、DNA提取：
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購北京百奧萊博科技有限公司生產的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
?液體培養物：取液體培養物100μL加到1.5mL無菌離心管中，8000rpm離心3min，盡量吸棄上清，加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
?固體培養物：挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
?糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
?其他液體標本：取標本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
 注：建議采用相關標準方法進行前增菌，并按照液體培養物方法進行提取。陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區域加入陽性對照。

三、檢測步驟：
1．試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qPCR反應液( O157(H7)-qPCR MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：

試劑	每個反應加入的量	N個反應加入的量
熒光PCR反應液	15μL	N×15μL

向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照( O157(H7)-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
2．qPCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。推薦循環條件：

	1循環	50℃ for 2 min
預變性	1循環	95℃ for 10 min
PCR擴增	40循環	95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃ 延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM，淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX 參比熒光。

四、結果分析：
1．結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
2．試驗成立判定
?陰性對照(NTC)：不應產生任何的擴增曲線。
?陽性對照(O157(H7)-PTC)：均產生擴增曲線。
?以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
3．結果判定
?在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明 O157(H7)核酸陽性。
?Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明 O157(H7)核酸陰性。
?如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
?對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行 O157(H7) qPCR檢測。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明 O157(H7)核酸陽性；否則判為樣本陰性。

五、注意事項：
?初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
?所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
?PCR操作應嚴格按照要求分區(試劑配制區、標本處理區、PCR擴增區等)，防止實驗室污染。
?樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區的超凈工作臺進行，以免污染。
?試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

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