F-0化學感受態細胞是高品質的克隆與表達產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于科學研究，我公司的F-0化學感受態細胞品質上佳，經過多年的開發生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括F-0化學感受態細胞在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：F-0化學感受態細胞
英文名稱：F-0 Chemically Competent Cell
產品貨號：MQ0024
產品規格：20×100μl/100×100μl

0菌株來源于MC1061，是目前實驗室zuì常用的感受態細胞之一，基因型與DH10B 高度類似(DH10B為galE15型，而0為galU型)。0生長速度快，37℃，10小時可見克隆。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取?？捎糜跇嫿寺?，藍白斑篩選等實驗。F-0感受態細胞經特殊工藝制作，無需42℃熱激，37℃孵育步驟，只需冰浴，10min內完成轉化、
涂板操作，pUC19質粒檢測轉化效率可達1~5×108 cfu/μg DNA。
保存條件：-80℃
基因型：
F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Strr)endA1 nupG
快速轉化操作方法(10min)：
1.提前15分鐘將用到的篩選培養基平板拿到37℃預熱。
2.F-0感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA(質?；蜻B接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻,，冰中靜置5分鐘。
3.用200μl槍將感受態細胞-DNA混合物轉移到已經37℃預熱的2YT或LB培養基上。
4.將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。如果進行藍白斑篩選操作，將平板放37℃培養至少13 h。
快速熱激轉化操作方法(25min,可提高轉化效率)：
1.F-0感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA(質?；蜻B接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻,，冰中靜置5分鐘。
2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘(晃動會降低轉化效率)。加入700 μl不含抗生素的LB，37℃，200 rpm復蘇10分鐘，涂板(均勻，表面無水漬)。
3.將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。如果進行藍白斑篩選操作，將平板放37℃培養至少15h。
注意事項：
1.F-0 快速轉化感受態細胞也可進行熱激操作，對于>7 kb質粒的構建，為了提高轉化效率可按以下步驟操作：F-0感受態細胞從-80℃拿出，插入冰中，5分鐘后，加入目的DNA并用手撥打EP管底輕輕混勻，冰中靜置20鐘。42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中靜置2分鐘。加入700 μl LB，37℃，200 rpm復蘇30分鐘，涂板。
2.感受態細胞zuì好在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率，混入目的DNA時應輕柔操作。
3.F-0 快速轉化感受態細胞涂氨芐/羧芐青霉素抗性平板時效率較高，若涂卡那霉素或其他抗生素平板，轉化效率下降(因無孵育步驟，卡那霉素等對菌體毒性較大)。若要提高卡那霉素或其他抗性質粒的轉化效率，可按熱激轉化操作，增加孵育步驟。

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名稱：胚胎裂解液
貨號：BTN130806
規格：1mL
本產品是胚胎培養過程中分離單個胚胎細胞的裂解液?？捎糜诜蛛x得到不同時期的胚胎的單細胞，得到的單細胞可用于各種單細胞分析，核酸提取等實驗。

儲存條件：低溫運輸，4℃保存，有效期兩年。

名稱：pUCm-T載體
貨號：BTN160101
規格：1μg
本產品是一種克隆PCR產物(TA Cloning)的專用載體。本載體由pUC系列載體改造而成，在pUC載體的多克隆位點處插入特殊的限制性內切酶識別位點，酶切后能在載體的3′端形成懸掛的“T”末端。很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產物雙鏈DNA 每條鏈的3′端加上一個突出的堿基A。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產物的兩端進行正確的AT 配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產物連接到，pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體?？梢酝ㄟ^藍白斑篩選有插入片斷的重組克隆，大大提高了3′末端A 突出PCR產物的連接、克隆效率。本產品應用于進行TA 克隆，克隆PCR產物。對克隆后的PCR產物可以用M13通用引物進行DNA 測序。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一. 實驗準備
1. PCR產物3′末端帶有突出的A堿基：Taq、Tth、Ampli Taq、Klen Taq DNA聚合酶擴增的PCR產物3′末端均帶有突出的A堿基。建議擴增的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行回收，再進行連接轉化實驗。
2. PCR產物3′末端沒有突出的A堿基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，其擴增的PCR產物末端可能不帶有3′A，要對這種平末端PCR產物進行克隆，應先對其進行3′末端加A，再進行連接轉化實驗。

二.連接反應
3.在一個標準的10mL連接反應體系中，加入下列成分：

反應組分	10μl反應體系
插入的目的片段	xμL(0.2 pmol)
本產品	1μL(50 ng)
10×連接酶緩沖液	1μL
T4 DNA連接酶	3-5 U
補水到	10 L

 注意:一般zuì后加入T4 DNA連接酶。
4. 用移液器吹打反應混合液使之混勻后，16-23℃連接1～12小時(或按T4 DNA連接酶供貨商提供的操作手冊進行連接)。

三．細菌轉化和鑒定
5. 將100μl感受態細胞置于冰上解凍后，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。
6. 加入上述5μl連接液，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。
7. 42℃水浴熱激90秒，再冰上放置15～20分鐘。
8. 加入400μl自備的SOC培養基，37℃ 200～250rpm振蕩培養1小時。
9. 4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μl上清液，用剩余的培養基將細胞懸浮。
10. 將細菌懸液均勻涂布在含20μl的IPTG(100mM)和100μl的X-gal(20mg/mL)的氨芐青霉素抗性的自備的LB平板上。(涂布菌液的用量可以根據連接的效率及感受態細胞的轉化效率而進行適當的調整。)
11. 將平板于37℃培養1小時，然后倒置培養過夜。(先將平板正向放置1小時，以吸收過多的液體。)

四．篩選
12.轉化子的藍白篩選：
 當外源DNA片段插入到pUCm-T載體中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重組克隆在-gal/IPTG 平板上呈現為白色，而非重組克隆呈藍色。選擇在IPTG/X-gal 平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉素的液體培養基，37℃培養過夜。
13.轉化子的鑒定：
1)用上述培養的白色菌落的菌液抽提質粒，用PstI單酶切或用其它合適的酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。
2)用M13通用引物或其它合適的引物直接進行測序來確定是否含有目的克隆。

操作提示：
1. PCR產物的純度：
 連接反應前需用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物，如果電泳檢測PCR產物條帶彌散，或出現非特異條帶，則需要切下目的條帶，用膠回收試劑盒對目的片段進行回收。若PCR產物電泳檢測只有預期大小的明顯條帶，也應使用PCR產物純化試劑盒直接純化PCR產物，以除去引物二聚體。不經純化的PCR產物在某些條件下可直接用于連接，但由于引物二聚體和PCR產物中其它物質的影響，造成含有插入片段的陽性克隆數減少，因而需要篩選很多克隆方可得到含有目的PCR產物的陽性克隆。
2. 平端PCR產物
 具有校正活性的熱穩定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在進行PCR擴增時產生平端PCR產物。這種平端PCR產物可以進行3′末端加A 尾后連接到pUCm-T載體中，采用這種方法進行連接，可大大提高克隆的效率。
3.優化插入片段和載體的摩爾比
1)pUCm-T載體優化的插入DNA片段和載體的摩爾比為3:1，采用3-10:1的連接比例也可成功進行連接。如果你的PCR產物開始連接的不理想，則有必要優化連接比例。
2)PCR產物的量可采用以下公式進行換算：
PCR片段的量(ng)= [加入載體的量(ng)×插入片段大小(kb)/載體大小(kb)]×插入片段和載體的摩爾比
4.篩選含插入片段的轉化子
插入片段成功克隆到pUCm-T載體中，可阻斷β-半乳糖苷酶的編碼序列，因而重組克隆可在指示培養基上通過顏色進行篩選。大多數情況下含有PCR產物的克隆菌為白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一讀碼框內，即PCR片段堿基數是3的整數倍(含3′-A)，并且讀碼框無終止密碼子，則重組克隆菌可能為藍色。

質粒圖譜：


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