間日瘧原蟲單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于科研試驗(yàn)，我公司專注于細(xì)菌PCR檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的間日瘧原蟲單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑質(zhì)量可靠，批間差小，且價(jià)格公道，熱切盼望您選購(gòu)我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括間日瘧原蟲單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：間日瘧原蟲單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品貨號(hào)：SYA124
產(chǎn)品規(guī)格：48次/盒

一、簡(jiǎn)介：
本試劑盒用一對(duì)間日瘧原蟲特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用熒光PCR 探針技術(shù)進(jìn)行間日瘧原蟲的檢測(cè)。

二、用途：
本試劑盒可用于間日瘧原蟲檢測(cè)鑒定及突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處置，還可用于間日瘧原蟲的環(huán)境監(jiān)測(cè)、衛(wèi)生檢疫及感染的輔助診斷，其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數(shù)量 規(guī)格
間日瘧原蟲熒光PCR 反應(yīng)液(qPCR MIX) 1管 672μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管
酶混合物(DNA Polymerase MIX) 1管 48μL/管
陰性對(duì)照(NTC) 1管 50μL/管
間日瘧原蟲陽性對(duì)照(PTC) 1管 50μL/管

四、熒光PCR 儀器適用范圍
ABI 系列，Bio-Rad 系列，Roche 系列等熒光定量PCR 檢測(cè)儀等。

五、儲(chǔ)存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期為6 個(gè)月。

六、實(shí)驗(yàn)操作步驟
6.1 標(biāo)本采集
血液：用一次性無菌5ml 注射器抽取疑似人或動(dòng)物血3-5ml，置于枸櫞酸鈉或EDTA2Na 抗凝管中，搖勻送檢。
肺臟等組織：取上述組織1g左右，置于1.5ml潔凈EP管中送檢。
乳液、體液等標(biāo)本：取相應(yīng)標(biāo)本3-5ml，轉(zhuǎn)至1.5ml潔凈EP管中送檢。
6.2 DNA提取
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進(jìn)行DNA核酸的粗提。也可采購(gòu)北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)，并按照相應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行操作。
血液樣本：直接取200μl 抗凝血，轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml 離心管中，加入1ml 雙蒸水，劇烈震蕩30s，8000rpm 離心5min，棄上清，至無明顯紅色沉淀。(若沉淀明顯，請(qǐng)?jiān)僦貜?fù)上述步驟一次)。加入1ml生理鹽水，劇烈震蕩15s，13000rpm 離心5min，棄上清。沉淀加入50μl 核酸提取液(使用前請(qǐng)室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm 離心3min，取上清4μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。
肺、淋巴結(jié)等固體組織：剪取約0.1g 組織，用生理鹽水洗去血污，剪碎加入0.5mL TE轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。將勻漿液50μl轉(zhuǎn)移到1.5mL 離心管中，加入50μl 核酸提取液(使用前請(qǐng)室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm 離心3min，取上清4μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。
乳液等液體標(biāo)本：取標(biāo)本2-3mL，13000rpm 離心3min，棄上清，沉淀加入50μl核酸提取液(使用前請(qǐng)室溫溶解并充分混勻)并與沉淀混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清4μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。
 注：陽性對(duì)照和陰性對(duì)照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL 加入到反應(yīng)體系中即可。由于陽性對(duì)照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對(duì)照。

七、檢測(cè)步驟：
7.1 PCR 擴(kuò)增
從試劑盒中取出熒光PCR 反應(yīng)液(間日瘧原蟲-qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm 離心10s。
設(shè)所需要的PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合液 1μL N×1μL
總量 15μL N×15μL
計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm 離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR 反應(yīng)管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(PTC)5μL，10000rpm 瞬時(shí)離心10 秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

八、結(jié)果分析：
8.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測(cè)結(jié)果。基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的zuì高點(diǎn)為準(zhǔn)。
8.2 試驗(yàn)成立判定
(1)陰性對(duì)照(NTC)：不應(yīng)產(chǎn)生任何的擴(kuò)增曲線。
(2)陽性對(duì)照(PTC)：均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。
(3)以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則，此次試驗(yàn)視為無效。
8.3 結(jié)果判定
(1)在試驗(yàn)成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明間日瘧原蟲核酸陽性。
(2)Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明間日瘧原蟲核酸陰性。
(3)如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對(duì)于可疑樣品，先看擴(kuò)增曲線。如果擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
(4)對(duì)于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進(jìn)行間日瘧原蟲real time PCR檢測(cè)。如果重復(fù)擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，判為樣本陽性，表明間日瘧原蟲核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項(xiàng)：
(1)初次使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。并嚴(yán)格按照說明書步驟操作。
(2)所有使用的離心管應(yīng)高壓滅菌，而且必須不含DNA 酶。
(3)PCR 操作應(yīng)嚴(yán)格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、PCR 擴(kuò)增區(qū)等)，防止實(shí)驗(yàn)室污染。
(4)樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以免污染。
(5)試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。


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