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特別提示：包括禽流感病毒H5亞型(AIV-H5)單重熒光PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：禽流感病毒H5亞型(AIV-H5)單重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA324
產品規格：48次/盒|96次/盒

一、簡介：
本試劑盒用一對禽流感病毒H5亞型特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術對禽流感病毒H5亞型RNA進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。本試劑盒中禽流感病毒H5亞型的探針報告基團為FAM。

二、用途：
本試劑盒適用于喉咽棉拭子、泄殖腔棉拭子、各種組織樣品、尿囊液及細胞培養液中的禽流感病毒H5亞型的特異性檢測。適用于禽流感病毒H5亞型感染的輔助診斷、監測及流行病學調查，其檢測結果僅供臨床參考。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數量 規格
禽流感H5熒光qRT-PCR反應液(H5-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
陽性對照(H5-PTC) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
按照相關標準采集。標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-80℃，但不能超過6個月，標本運送應采用0℃冰壺。
6.1.1 血清：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(22-25℃)放置30-60min，血標本可自發完成凝集析出血清，或直接使用水平離心機，3000rpm離心5min，吸取上層血清，轉移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.2 血漿：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)或檸檬酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5-10min后即可分離出血漿，轉移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.3 拭子、分泌物等樣品：在裝有拭子或分泌物的離心管中加入500μL PBS或生理鹽水，劇烈振蕩30s。棉拭子盡量擠出液體轉移到無RNA酶污染的離心管中，6000rpm離心20s，取上清備用。
6.1.4 病灶組織樣品：稱取組織約0.1g于研磨器或組織勻漿器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理鹽水研磨至無塊狀物，然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液于1.5mL滅菌離心管中。
6.2 RNA提取
可按常規方法提取，也可采用商品化試劑盒提取病毒RNA。
6.2.1 取無RNA酶的1.5 mL Eppendorf離心管，做好標識。
6.2.2 加入600μL裂解液，200μL樣本，200μL氯fǎng，混勻器上振蕩5 s，4℃ 12000 rpm離心15 min。
6.2.3 吸取步驟6.2.2中的上清液轉移至新的無RNA酶的1.5 mL Eppendorf離心管中(避免吸出中間層)，加入400 μL 異丙醇，顛倒混勻。
6.2.4 4℃ 12000 rpm離心15 min，棄上清；加入600 μL 75％乙醇。
6.2.5 4℃ 12000 rpm離心10 min，棄上清。打開離心管管蓋，室溫干燥5 min-10 min。
6.2.6 加入10μL 無核酸酶水，溶解管底的RNA，5000 rpm離心5 s，-20℃保存。若長期保存需放置-80℃冰箱。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR反應液(H5-qRT-PCRMIX)、酶混合物(EnzymesMIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合液 1μL N×1μL
總量 15μL N×15μL
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加15μL，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(H5-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qRT-PCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
反轉錄(Reverse Transcription) 1循環 45℃ for 10 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。

八、結果分析
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
(1)陰性對照(NTC)：不應產生任何的擴增曲線。
(2)陽性對照(H5-PTC)：均產生擴增曲線。
(3)以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結果判定
(1)在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明H5核酸陽性。
(2)Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明H5核酸陰性。
(3)如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
(4)對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行H5qRT-PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明H5核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項
(1)初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
(2)所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA酶。
(3)PCR操作應嚴格按照要求分區(試劑配制區、標本處理區、PCR擴增區等)，防止實驗室污染。
(4)樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區的超凈工作臺進行，以免污染。
(5)試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。



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