本試劑盒采用高品質原料，經大量樣本實驗驗證優化配方。穩定性高，檢測方便，可檢測pg級的抗原。...

產品特點：

● 高靈敏度

● 低背景

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 移液器 ● 雙蒸水

注意事項：

● ECL工作液配制過程中吸取試劑A和試劑B時務必跟換吸頭，工作液新鮮配制后立即使用，放置過久會影響靈敏度。

● 根據蛋白豐度不同曝光時間可能是數秒至數小時。

● 曝光時間過長會使背景加深，曝光不足會導致條帶模糊。

● 如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發光和曝光。

● 必須使用高質量保鮮膜。

使用方法：

1、使用合適的方法進行Western，直至用PBST洗滌二抗。

2、配制新鮮ECL工作液：試劑A和試劑B按1:1混合均勻后即為ECL工作液。須立即使用！

3、印跡膜蛋白面朝上，用ECL工作液均勻滴加至印跡膜使其完全覆蓋。ECL工作液使用量大約為0.125mL/cm²膜或根據個人實驗習慣使用。

4、用平頭鑷夾住印跡膜，垂直置于吸水紙以吸去自然流下的多余工作液，注意不能讓膜完全干掉。

5、快速將印跡膜置于二層保鮮膜之間，盡量趕盡氣泡。

6、將印跡膜蛋白面朝上，放于X光膠片暗盒內。（如果用顯像儀器直接置于儀器中拍照即可）

7、在暗室內放入X光片，曝光，顯影。如果在暗室中可肉眼看到比較亮的條帶，建議曝光1分鐘-3分鐘；如果肉眼看到的帶比較淡，建議曝光3-10分鐘；如果很淡或基本看不到帶，建議曝光10分鐘-30分鐘。

常見問題分析：

● 為什么會發生熒光淬滅？

抗原濃度太高，局部過多HRP會快速消耗底物，導致熒光信號過強，條帶呈灼燒樣。可降低抗原上樣量。

操作時間過長，膜逐漸干掉。避免膜干掉。

不良的實驗習慣導致設備或試劑污染。例如鐵銹和不慎沾染的顯影液、定影液，會造成熒光淬滅，甚至直接導致無熒光。

● 為什么會出現高背景？

抗體濃度過高，洗滌不充分，可以造成抗體在膜上的非特異結合，導致高背景。可通過降低抗體稀釋度，增加洗膜次數和Buffer用量，或在Wash Buffer中添加終濃度0.05%的Tween-20 加以改善。

封閉不充分，會造成抗體在膜上的非特異結合，導致高背景。可通過4℃封閉過夜或增加封閉液中的蛋白濃度加以改善。

使用了不恰當的封閉劑，可嘗試不同的封閉劑。

曝光過度，可減少底物顯色時間，縮短曝光時間。

操作過程中膜干了。確保膜完全浸沒于buffer 中，始終杜絕膜干。

● 膠片上條帶很濃怎么辦？

可減少蛋白上樣量；

降低一抗二抗稀釋度，減少抗體孵育時間；

如果背景深的話，則要把發光液瀝干些再壓片；如果背景不深則需減少發光時間和顯影時間。

● 膠片上條帶很弱是什么原因？

因為蛋白上樣量低或目的蛋白在來源組織或細胞中的表達量并不豐富造成。可適當加大蛋白上樣量，也可通過提高抗體稀釋度或采用靈敏度更高的發光底物來調整。

蛋白沒有充分轉移到膜上。轉膜后可通過預染Marker 判斷轉膜效率，也可用麗春紅染膜、用考馬斯亮藍染膠，判斷轉膜效率。

抗體效價不高，用量不足，孵育時間太短，或抗體反復使用保存不當而失活。

可考慮更換效價更高的抗體，或提高抗體稀釋度，延長抗體孵育時間；若懷疑抗體失活，可用斑點雜交實驗確定抗體活性。

曝光時間太短。可適當延長曝光時間。

● 出現非特異條帶是什么原因？

蛋白上樣量過大。可降低蛋白上樣量。

一抗是多克隆抗體，或一抗、二抗濃度太高。可更換成單克隆抗體，或降低抗體濃度，縮短抗體孵育時間，優化一抗和二抗的使用濃度。

洗膜不充分。可增加洗膜次數和Buffer用量，延長洗膜時間，或在Wash Buffer中添加終濃度0.05%的Tween-20。

目的蛋白在體內存在多種修飾形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等。可查閱文獻，用合適的方法去除蛋白的修飾，或選擇合適的抗體。

目的蛋白降解。重新準備蛋白樣品，并加入足夠的蛋白酶抑制劑。

● 如何判斷ECL 是否失效？

準備ECL工作液1mL到一個干凈的EP管中，加入1μL未稀釋的HRP酶標二抗到EP管中，混勻后即可看到管內發出藍光，并在隨后的幾分鐘內持續發光，表示底物活性正常。若不發光則說明ECL失效了。

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