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微載體培養技術介紹

發布時間:2020-11-06瀏覽次數:1205返回列表

(一)概述

微載體培養技術于1967年被用于動物細胞大規模培養。該技術目前已漸日趨完善和成熟,并廣泛應用于生產疫苗、基因工程產品等。

微載體培養是目前公認的zui有發展前途的一種動物細胞大規模培養技術,其兼具懸浮培養和貼壁培養的優點,放大容易。

目前微載體培養廣泛用于培養各種類型細胞,生產疫苗、蛋白質產品,如293細胞、成肌細胞、Vero細胞、CHO細胞。


微載體是指直徑在60.250μm,能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自VanWezel用DEAE-SephadexA50研制的第1種微載體問世以來,國-際市場上出售的微載體商品的類型已經達十幾種以上,包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯飽沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種:Cytodexl、2、3、Cytopore和Cytoline。

增大單位體積內表面積(S/F)對細胞的生長非常有利。微載體直徑盡可能小,zui好控制在100-200μm之間。培養體系內微載體的密度一般為1.03-1.05g/cm2,隨著細胞的貼附及生長,密度可逐漸增大。控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質。若電荷密度太低,細胞貼附不充分,但電荷密度過大,反而會產生“毒性”效應。

(二)微載體培養原理與操作

1.微載體培養原理

將無細胞毒性的微載體顆粒加入到培養容器的培養液中,使細胞在微載休表面附著生長,同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。貼壁依賴性細胞在徽載體表面上的增殖,要經歷戮附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖,故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。豁附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面豁附,主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

2.微載體培養操作

攪拌轉速由于動物細胞無細胞壁,對剪切力敏感,因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作是,在貼壁期采用低攪拌轉速,時攪時停。數小時后,待細胞附著于微載體表面時,維持設定的低轉速,進入培養階段。微載體培養的攪拌非常慢,zui大速度75r/min。

細胞與微載體的相融性好壞,與微載體表面的理化性質有關。一般細胞在進入生理pH值時,表面帶負電荷。若微載體帶正電荷,則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷,因靜電斥力使細胞難于赫附貼壁,但培養液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時,則帶負電荷的細胞也能貼附。

影響細胞在微載體表面生長的因素很多,主要有三個方面:①培養細胞方面,如細胞群體、狀態和類型。②微載體特性方面,如微載體表面狀態、吸附的大分子和離子。徽載體表面光滑時細胞擴展快,表面多孔則擴展慢。③培養液組成及其特性,如培養基組成、沮度、pH、DO以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件zui優,則細胞生長快,反之生長速度慢。

微載體培養操作要點:①培養初期。保證培養基與微球體處于穩定的pH與溫度水平,接種對數生長中晚期細胞至終體積1/3的培養液中,以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量,geng高的微載體濃度需要控制環境或經常換液。②貼壁階段。3-8d后,緩慢加入培養液至工作體積,并且增加攪拌速度保證完全均質混合。③培養維持期。進行細胞計數、葡萄糖測定及細胞形態鏡檢。隨著細胞增殖,微球變得越來越重,需增加攪拌速率。經過3d左右,培養液開始呈酸性,需換液。換液時,停止攪拌,讓微珠沉淀5min,棄掉適宜體積的培養液,緩慢加入37℃新鮮培養液,重新開始攪拌。④收獲細胞。首先排干培養液,至少用緩沖液漂洗1遍,然后加入相應的酶,75-125r/min快速攪拌20-30min。然后解離收集細胞及其產品。

可以通過增加微載體的含量或培養體積進行微載體培養的放大。使用異倍體或原代細胞培養生產疫苗、干擾素,已被放大至4000L以上。

(三)微載體培養的優點

微載體培養由于表面積/體積(S/V)大,因此單位體積培養液的細胞產率高。把懸浮培養和貼壁培養融合在一起,兼有兩者的優點。可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況。簡化了細胞生長各種環境因素的檢測和控制,重現性好。培養基營養成分的利用率較高。容易放大,細胞收獲過程不復雜,勞動強度小,培養系統占地面積