1.樣本準備：

1） 收集細胞。經刺激和阻斷處理的細胞（具體處理方案請參考文獻進行），加細胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）制成單細胞懸液，調整細胞濃度約為1×107/ml。

2） 取100μl細胞/管（約1×106細胞），分別加到做好標記的流式管底部。

2.固定：

1） 如需要表面染色，選用適宜抗體進行表面染色。

2） 用100uL的1×細胞固定/破膜液（Fixation/Permeabilization buffer），將流式管中的細胞重懸，室溫避光孵育30分鐘。

3） 用300g離心5分鐘，棄去上清。

3.破膜：

1） 用2mL的1×細胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）將固定過的細胞重懸，300g離心5分鐘，棄去上清。

2）重復洗一次，300g離心5分鐘，棄去上清。

3） 加入1ml的1×細胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer），4℃避光孵育30分鐘；300g離心5分鐘，棄去上清。

4.胞內染色：

1）用100μl 的1×細胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）重懸細胞，加入相應的抗體，混勻，4℃避光孵育至少30分鐘。

2）加入2ml的1×細胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）重懸細胞，300g離心5分鐘，棄去上清。

3）加入2ml的1x細胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）懸起細胞，300g離心力離心5分鐘，棄去上清。

4）加入0.5ml的1x細胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測和分析。

注意事項：

1. 同一個細胞同時做細胞表面和細胞內的蛋白，建議先做細胞表面染色，再固定、破膜。

2. 細胞內染色推薦使用同型對照。