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怎么建穩轉株才能真的穩?
發布時間:2021-11-18瀏覽次數:1066返回列表
穩定轉染,即進入細胞的質粒整合入細胞基因組中,并能隨細胞分裂穩定傳遞下去。這是相對瞬時轉染而言的。
瞬時轉染的表達時間短暫,外源基因導入整合基因組的幾率非常低,絕大部分以游離形式存在,不能隨細胞分裂而一同復制,導致后拷貝數被稀釋,無法達到持續表達外源基因的目的。一般用轉染試劑進行質粒轉染,多為瞬時轉染。
一般如下情況需要構建穩定株:
1) 長期在目的細胞中研究基因功能,通過構建穩定株,可以大大降低頻繁轉染或者病毒包裝的成本,也極大方便實驗研究;
2)部分蛋白半衰期極長,瞬時RNA只能干擾表達,無法去除已經表達的目的蛋白,通過構建穩定株可以實現好的基因干擾效果;
3)瞬轉往往會引入極高拷貝數的表達,導致因為人為因素造成實驗結果的不,構建穩定株可以幫助篩選拷貝數適量的細胞進行實驗研究;
4)需要用誘導表達系統的,主要是一些致死基因或者是需要時空表達的;
5)需要用細胞做動物實驗的,比如裸鼠成瘤等,往往需要構建成穩轉株。
構建穩定株的方法:
其實用脂質體轉染、磷酸鈣轉染法等理論上是可以構建穩定株的,但這些方法整合入基因組的效率極低,很難成功。而慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組,效率很高,是建立穩定株的優方式。
構建穩定株的注意點:
穩定株構建是個長期過程,從質粒構建到慢病毒包裝,再到細胞感染及后期的篩選,每一步都至關重要,所以建立穩轉株花個半年時間,也是常有的事,而且要承擔病毒包裝不成功,細胞感染效率低等風險。