細胞培養(yǎng)用液的配制具體步驟與消毒方法

  1.血清的滅活

  細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃ 水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

  2.HEPES溶液

  HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。對細胞性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol /LHEPES即可達到緩沖能力。

  1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：

  準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。

  注意：因為現(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全(20ml)加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。

  3.谷氨酰胺

  合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50%，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。

  一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

  4.肝素溶液的配制：

  含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中終濃度為50ug/ml。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為?? ℃ 。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml(可加入0.9ml)即可。

  5. Ⅰ型膠原酶：

  0.1%Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

  6..明膠溶液：

  因為明膠難于過濾，所以配制0.1%明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克(配成100ml溶液)—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

  注意事項：

  1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

  2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

  3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值終為7.2，可在配制時調(diào)PH至7.4。

  經(jīng)驗總結(jié)

  1.明膠難溶，就稱好，加pbs，高壓滅菌，就ok了;

  2.血清，不用滅活，我養(yǎng)海馬神經(jīng)元和乳鼠根本不滅活，好的很，但有些細胞如平滑肌需要;

  3.雙抗，由于其特殊性，水解，從來不加，只要操作ok，不需要;

  4.培養(yǎng)基重要，尤其對于自己配制的，有時候就是不好，ph和滲透壓問題，一定要解決好。

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