免疫熒光雙標技術中操作要點和注意事項

  一、免疫熒光的標本制作的基本程序同DAB顯色的免疫組化，不同點如下：

  1. 免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同。

  2. 免疫熒光的二抗使用不同熒光標記的二抗孵育，孵育時間根據抗體的工作濃度確定。

  3. 二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。

  4. 免疫熒光在封片使用專用封片劑或甘油：0.01MPBS (1：1)。

  5. 條件許可可以購買防淬滅的試劑加入封片劑中，標本可以保存久。

  6. 熒光抗體的孵育以及后續處理需要閉光。

  7. 熒光抗體染色假陽性可能會多，需要設定陽性和陰性對照。

  二、注意事項

  1. 熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。

  2. 每次試驗時，需設置以下三種對照：

  (1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物

  (2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物

  (3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物

  三、免疫熒光雙標的經驗之談

  1. 選取primary antibodies時要來源于兩種不同的動物，用來源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號標記的，用donkey anti-rabbit-FITC(綠)和donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。

  2. 我的做法是兩種primary antibodies同時孵育，然后兩種secondary antibodies同時孵育。抗體濃度、孵育時間要認真摸索，感覺primary antibodies 4度孵育過夜比較好，背景比較干凈。

  3. 我的陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。

  4. Block用的血清使secondary antibody來源動物的血清，我的是10%正常donkey血清。

  5. 其余同一般操作。

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