還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)試劑盒說(shuō)明書(shū)

  微量法 100T/96S

  注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

  測(cè)定意義：

  GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化巰基物質(zhì)，在抗氧化、蛋白質(zhì)巰基保護(hù)和氨基酸跨膜運(yùn)輸?shù)戎芯哂兄匾饔谩＿€原型與氧化型比值(GSH/GSSG)是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的主要?jiǎng)討B(tài)指標(biāo)。因此，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)。

  測(cè)定原理：

  DTNB與GSH反應(yīng)生成復(fù)合物，在412nm處有特征吸收峰;其吸光度與GSH含量成正比。

  自備儀器和用品：

  低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

  試劑組成和配制：

  試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

  試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

  試劑三：液體×1瓶，4℃避光保存。

  粗酶液提取：

  組織：按照組織質(zhì)量(g)：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

  細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè))：試劑一體積(mL)為500~1000：1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一)，冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min);然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

  血清等液體：直接測(cè)定。

  GSH測(cè)定操作：

  1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

  2. 試劑二置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動(dòng)物)水浴中保溫30min。

  3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL蒸餾水，140μL試劑二，40μL試劑三，混勻靜置2min后測(cè)定412 nm吸光度A1。

  4. 測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，140μL試劑二，40μL試劑三，混勻靜置2min后測(cè)定412 nm吸光度A2。

  注意：空白管只需要測(cè)定一次。

  GSH含量計(jì)算公式：

  GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=1.5 x(x為GSH濃度，μ mol /mL;y為吸光值)

  a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

  (1)按蛋白濃度計(jì)算

  GSH(μ mol/ mg prot)=(A2-A1) ÷1.5×V樣÷(V樣×Cpr) =0.667×(A2-A1) ÷Cpr

  (2)按樣本質(zhì)量計(jì)算

  GSH(μ mol/g 鮮重)=(A2-A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=0.667×(A2-A1) ÷W

  (3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

  GSH(μ mol /104 cell)=(A2-A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)=0.667×(A2-A1) ÷細(xì)胞數(shù)量

  (4)按液體體積計(jì)算

  GSH(μ mol/ mL)=(A2-A1) ÷1.5×V樣÷V樣 =0.667×(A2-A1)

  V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL;V樣總：上清液總體積，1 mL;V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL;Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL;W：樣品質(zhì)量

  b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

  GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=0.75x(x為GSH濃度，μ mol /mL;y為吸光值)

  (1)按蛋白濃度計(jì)算

  GSH(μ mol/ mg prot)=(A2-A1) ÷0.75×V樣÷V樣÷Cpr =1.334×(A2-A1) ÷Cpr

  (2)按樣本鮮重計(jì)算

  GSH(μ mol/g 鮮重)=(A2-A1) ÷0.75×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=1.334×(A2-A1) ÷W

  (3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

  GSH(μ mol /104 cell)=(A2-A1) ÷0.75×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)=1.334×(A2-A1) ÷細(xì)胞數(shù)量

  (4)按液體體積計(jì)算

  GSH(μ mol/ mL)=(A2-A1) ÷0.75×V反總÷V樣 =1.334×(A2-A1)

  V樣總：上清液總體積，1mL;V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL;Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL;W：樣品質(zhì)量，g。

  注意事項(xiàng)：

  試劑一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。

  低檢出限為0.011mmol/L。

  還原型谷胱甘肽試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專(zhuān)門(mén)從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷(xiāo)售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷(xiāo)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹(shù)立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。