如何正確使用血清,血清在細胞培養(yǎng)中的作用

  血清，指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白已被除去的血漿。血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。氨基酸有多種，是細胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，其中有些氨基酸動物細胞本身不能合成(稱為必需氨基酸)，必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子(如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、類胰島素生長因子等);血清還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，細胞培養(yǎng)時，要保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需添加10%～20%的血清，動物血清還可起到酸堿度緩沖液的作用。

  常用血清種類

  目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用兔血清、馬血清等。

  選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經(jīng)過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。

  牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用兔血清、馬血清等其他血清。牛血清是細胞培養(yǎng)中用量大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。

  牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分少。

  常見血清及規(guī)格

  胎牛血清：(八月齡胎牛心臟穿刺取血)

  適用于細胞株保藏及嬌貴細胞培養(yǎng)。

  超級新生牛血清：(出生12～24小時新生牛靜脈采血，采血后靜置自然析出的血清)

  適用于淋巴細胞、骨髓瘤細胞、二倍體細胞等基礎生物醫(yī)學研究。

  標準新生牛血清：(出生12～24小時新生牛靜脈采血，經(jīng)離心分離的血清)

  BVDV 抗原抗體均陰性，適用于原代、傳代細胞培養(yǎng)和人用疫苗(vaccine)生產(chǎn)和研制。特別適用于豬瘟疫苗(vaccine)的研制、生產(chǎn)。

  普通新生牛血清：(出生12～24小時新生牛靜脈采血，融血或微融血的血清)

  適用于普通原代、傳代細胞培養(yǎng)和獸用疫苗(vaccine)及診斷試劑生產(chǎn)

  小牛血清：(出生三月齡小牛動脈采血分離血清)

  適用于生物醫(yī)學研究等。

  大牛血清： 適用于標準蛋白液、膽固醇液及牛血清白蛋白制備等。

  馬血清： 適用于獸用疫苗(vaccine)生產(chǎn)和診斷試劑生產(chǎn)。

  山羊血清：適用于生物醫(yī)學研究基礎等。

  血清質(zhì)量的差異性大如何選擇

  市場上各種血清產(chǎn)品魚龍混珠，一不小心，你可能就使用了品質(zhì)不好的血清。

  血清按照采血時間可分為胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，三者的優(yōu)劣順序為：胎牛血清>新生牛血清>小牛血清。

  一般細胞建議使用胎牛血清培養(yǎng)，部分細胞可使用新生牛血清培養(yǎng)，小牛血清則不建議用于細胞培養(yǎng)。

  血清在生產(chǎn)中受采血來源，條件和生產(chǎn)工藝等的影響，質(zhì)量差異較大，即使相同廠家不同批次的血清都會有差異;另外不同種類的細胞對血清的適應也有不同，這可能與血清中所含的生長因子有關，所以血清在使用之前應提前驗證一下對所培養(yǎng)的細胞生長的促進作用。

  培養(yǎng)細胞用的培養(yǎng)基為人工合成，但動物細胞生活的內(nèi)環(huán)境還有一些成分尚未研究清楚，加入動物血清是為了給體外培養(yǎng)的細胞提供一個類似生物體內(nèi)的環(huán)境，此外動物血清中也包含了一些動物的激素和酶，可以促進細胞的發(fā)育主要作用有

  a、提供基本營養(yǎng)物質(zhì)或合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)：如氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等;

  b、提供有利于細胞生長增殖所需的激素、生長因子;

  c、提供貼壁細胞所需的貼壁因子和擴展因子;

  d、對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，使細胞免受蛋白酶的損傷;

  e、血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用;

  f、血清中的結合蛋白還可消除某些毒素和金屬對細胞的毒性作用。

  細胞培養(yǎng)中如何正確使用和保存血清

  保存：胎牛血清一般在-20℃以下冷凍保存，使用之前應先放到2~8℃冰箱過夜溶解，不建議直接放到室溫或37℃水浴溶解(升溫過快會導致血清中蛋白質(zhì)大量沉淀，影響血清質(zhì)量);若一次使用量不多，可溶解后分裝至小包裝凍存，避免反復凍融。血清解凍后在2~8℃保存時間一般不超過一個月。

  滅活：一般血清使用時不需要滅活。滅活的作用是消除血清中的各種補體成分，但事實證明血清滅活之后會產(chǎn)生大量的沉淀，會對血清的營養(yǎng)物質(zhì)造成較大破壞，對細胞的生長不利。

  沉淀：血清中的沉淀一般為析出的纖維蛋白，另外新生牛血清中各種蛋白含量明顯偏高，溶解時較易產(chǎn)生大量沉淀。血清中出現(xiàn)沉淀一般不會影響血清質(zhì)量，并且升溫至37℃時會溶解(不建議加熱血清);若沉淀量較多，可在400×g離心3min，取上清使用。血清和添加了血清的培養(yǎng)基在使用時不需要過濾。

  血清使用中可能遇到問題

  a、如何換使用血清

  需要換使用不同品牌或批次的血清之前，需提前對要使用的血清進行驗證，可使用自己經(jīng)常培養(yǎng)的細胞進行，保證該血清對細胞生長的促進作用。在換使用時可以將要換的血清和原本使用的血清1:1混合使用1~2代，待細胞完全適應后進行換。

  b、血清顏色的問題

  血清顏色主要是黃色或紅色，一般淡黃色或微紅色為正常。這個主要受血紅蛋白含量的影響，若顏色太深(接近培養(yǎng)基的顏色)，則有可能是采血過程中出現(xiàn)溶血導致的。

  c、血清沉淀的問題

  血清中的沉淀主要是纖維蛋白凝集產(chǎn)生的，一般來說每次凍融都會產(chǎn)生一部分的沉淀，但不影響血清質(zhì)量和使用。另外，血清在加入到培養(yǎng)基中后也是有可能會產(chǎn)生沉淀的，特別是滅活后的血清，會持續(xù)產(chǎn)生黑色顆粒，這可能會被錯誤判斷為污染。一般血清產(chǎn)生的沉淀在顯微鏡下觀察為微小的不規(guī)則絮狀或者顆粒物質(zhì)，排查是否為污染好的辦法是用瓊脂板檢測。

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