ELISA實驗“溫育”操作是只能在37℃條件下完成嗎？

  溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關鍵的一個因素。ELISA實驗作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，也被稱之為孵育。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。

  溫育的時間選擇

  溫育這一步是ELISA測定中容易出現問題的步驟。目前國內ELISA試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鐘-1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1-2小時才能有較完全的結合，低于1小時，可能會影響測定下限。

  ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。

  溫育的溫度選擇

  溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用高的溫度。抗原抗體反應4℃為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中放置一晚上，以形成zui多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

  在建立ELISA方法作反應動力學研究時，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用高的溫度。抗原抗體反應4℃為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

  溫育的方式選擇

  溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結果的吸光度差異(“邊緣效應”即外周孔顯色較中心孔深)。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。

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