脈動真空滅菌器滅菌利用機械抽真空的方法，使滅菌室內形成負壓，蒸汽得以迅速穿透到物品內部，與器械接觸后飽和蒸汽釋放出大量的潛熱（2250KJ），當蒸汽遇到冷的滅菌物品時即冷凝成水，釋放全部潛熱，使滅菌物品的溫度快速的升高，迅速升高的溫度使細菌中的蛋白質凝固變性，從而將所有微生物包括細菌芽孢全部殺死。脈動真空滅菌器滅菌時程序的運行過程如下：
    一、脈動
    對滅菌器內室進行抽真空、進蒸汽操作，反復進行三次，然后再次抽真空，待內室壓力到達脈動下限后，程序轉入升溫階段。經過該階段后，內室的冷空氣排除率可達到99%以上，確保內室無死點，保證滅菌的合格。 
    二、升溫
    蒸汽經過滅菌器夾層進入內室，對器械進行加熱，同時內室疏水閥間歇性開啟，將蒸汽冷凝后產生的水排出。內室溫度達到設定值后程序轉入滅菌階段。 
    三、滅菌
    開始滅菌計時，在此期間內室進汽閥受到內室溫度和壓力的共同控制以確保內室保持在一定的溫度范圍內對器械進行滅菌。當內室溫度高于滅菌器設定的數值上限時，進汽閥關閉，低于數值下限時，進汽閥打開；同時，當內室壓力高于數值上限時，進汽閥也會關閉，低于內室壓力下限值時，進汽閥打開以確保滅菌階段溫度的上下波動不超過3°。滅菌計時結束后，程序轉入排汽階段。 
    四、排汽
    排汽閥打開，內室的蒸汽在內外壓差的作用下排出，經過換熱器的作用，大部分蒸汽冷凝成水，少部分蒸汽經過濾后排至大氣。內室壓力下降到設定值后，程序轉入干燥階段。 
    五、干燥
    真空泵打開對內室進行抽真空，同時夾層保持一定的壓力和溫度，起到烘干器械的作用。 
    六、結束
    蜂鳴器呼叫，此時可以打開門將滅菌車推出進行器械的晾放。