線粒體橙色熒光探針——MitoOrange
Cat number：KFS160
Store at -20℃ for 6 months，避光
For Research Use o
一、產品描述
具有細胞膜滲透性的 MitoOrange（分子量 427.4）探針包含一個溫和的巰基反應性氯甲基基團，可用于標記線粒體，并在固定之后保留在線粒體內。標記線粒體，細胞可以與 MitoOrange 探針簡單孵育，探針通過被動擴散傳過質膜，并在有活性的線粒體內富集。一旦線粒體被標記，細胞再用醛基類固定劑固定之后，就可以進一步做下游實驗的深入處理。這些 MitoOrange 染料可以解決一些致病性細胞上研究所面臨的困難，因為標記線粒體可以在細胞被固定之前開展。
雖然傳統的熒光染料，如四甲基羅丹明和羅丹明 123，很容易識別功能性線粒體，但是這些染料一旦在線粒體去化時也很容易被洗滌出線粒體。這些缺點限制了常規染色實驗中所用的醛類固定劑，以及一些實驗用的處理藥品的選擇。而 MitoView 染料可以很好的解決這一問題。
MitoOrange：Ex/Em=554nm/575nm
二、產品包裝
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組份 |
KFS160 ≥100 tests for 6 wells |
儲存條件 |
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線粒體橙色熒光探針MitoOrange |
0.5mM in DMSO，100μL |
-20℃，避光 |
三、操作說明
細胞制備與染色
的染色探針濃度取決于不同的應用程序類型，此處建議的初始條件是基于驗證的特定細胞類型，具體實驗中應摸索加以調整。
1.1 準備染色：本試劑盒提供的 MitoOrange 大約為 0.5mM，用之前，以 HBSS 或不含血清、酚紅的培養
基稀釋探針原液至工作液濃度。（一般來說，活細胞標記，探針工作濃度為 25~500nM，如果是固定的細
胞，濃度一般為 100~500nM，為了減少可能的線粒體毒性超負荷，選擇盡可能低的染料濃度。）
對于 96 孔培養板中的細胞樣品而言，每孔染色工作液體積 100μL 足夠標記，本試劑盒可以提供至少
1000 次測試；對于 6 孔板培養的細胞樣品，每孔染色工作液體積 1ml 足夠標記，本試劑盒至少可以提
供 100 次測試。
1.2 染色貼壁細胞：以 1.1 步準備的預熱染色液，37 度孵育 15~45 分鐘。完成染色后，更換新鮮預熱的培
養基或緩沖液，用熒光顯微鏡或者熒光酶標儀觀察細胞。如是固定細胞，繼續染色后的固定和通透處理。
1.3 染色懸浮細胞：離心細胞，棄上清，用預熱的 1.1 步配制的染色液懸浮細胞，37 度孵育 15~45 分鐘。
完成染色后，更換新鮮預熱的培養基或緩沖液，用流式細胞儀或者熒光微孔板讀數儀、或者熒光顯微鏡進
行分析。如需固定細胞：用多聚-D-賴氨酸處理的載玻片，繼續染色后的固定和通透處理。
可選步驟：染色后的固定和通透
2.1 洗滌細胞：染色完成后，用預熱的新鮮培養基或緩沖液洗滌細胞。
2.2 固定細胞：小心出去培養基或者緩沖液，用新鮮配制預熱的含 2~4%甲醛的培養基替代。
2.3 洗滌細胞：固定完成后，緩沖液洗滌多次。
2.4 通透處理（可選）：可選擇 Triton X-100 去污劑通透，如內皮細胞用含有 0.2%的 Triton X-100-PBS 孵
育 10 分鐘，或者在冰冷的丙酮中浸泡 5 分鐘，再以 PBS 洗滌。
