Ca²⁺GPCR 分析-鈣離子指示探針 Fluo-3

 

Cat number：KFS167

Store at -20℃ for 6 months，避光

For Research Use only

 

一、產品描述

 

Fluo-2 早是由 Roger Tsien 博士發明的鈣離子指示劑 Fluo 系列之一，目前，Fluo-3 和 Fluo-4 已成熟商品化。然而，Fluo-2 在細胞內比 Fluo-4 要更明亮，主要可能是由于大部分細胞對 FLuo-2 的加載能力要高于 FLuo-4。

 

Fluo-3 成像涉及到鈣離子信號通路的多個方面，Fluo-3 經常應用在流式細胞術上，如螯合劑光活化、第二信使、神經遞質以及細胞水平的藥理篩選。Fluo-3 在這些應用里之所以能大量運用主要是由于其幾個重要特性：Fluo-3 可以被氬離子激光器 488nm 激發，并在與 Ca2+結合后，發射熒光很明亮的熒光信號。Fluo-4 是 Fluo-3 以兩個氟原子取代氯原子的類似物，這一微小的結構變化使得 Fluo-4探針在 488nm 激發光下的熒光信號得到增強，信號穩定持續，可以應用于共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、微孔板讀數儀。

 

Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 在與 Ca2+結合后熒光增強，與紫外激發的探針 fura-2 和 indo-1 不同，不會發生光譜漂移。熒光光密度在與Ca2+結合后，增強至少 100 倍。Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 的光譜特性，見下表

 

 

Property	Fluo-2	Fluo-3	Fluo-4
Kd (Ca2+)	390 nm	325 nm	345 nm
Excitation	490 nm	506 nm	494 nm
Emission	515 nm	526 nm	516 nm

 

 

二、產品包裝

 

組份	KFS167	儲存條件
Fluo-3, AM 儲液	1mM in 無水 DMSO，200μL	-20℃，避光
Pluronic F-127	20%（w/V），200μL	4℃

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

三、操作說明

 

下面操作可能需要用到的 20% Pluronic F-127 助溶劑，需另外購買或客戶自備。加載細胞說明加載細胞，建議使用膜透性的 AM 酯類形式的探針，如下操作建議僅供參考。

 

1. 合適培養基稀釋一份 DMSO 儲液（1mM）到 1~5μM 的終濃度，加入非離子型去污劑 Pluronic F-127 可以協助非性的 AM 酯在水溶液中的擴散?？梢院唵蔚耐ㄟ^先等體積混合 20%（w/V）的 Pluronic 與 DMSO，確保 Pluronic 在加載到細胞中的工作濃度是 0.02%。

2. 有機陰離子轉運抑制劑 probenecid（1~2.5mM）或 sulfinpyrazone (0.1–0.25 mM)可以添加到細胞培養基中，以減少探針在胞外的脫酯現象。Probenecid 和 sulfinpyrazone 儲液基本為堿性，因此在添加到培養基中時需要先調整到與所用培養基匹配的 pH。

 

3. 細胞通?？梢耘c AM 酯探針在 20~37 度條件下孵育 15~60 分鐘，的探針加載濃度、時長與溫度需要在實驗中具體摸索確定。一般來說為了減少可能的毒性超負荷，只要滿足足夠的熒光檢測強度，選擇盡可能低的染料濃度。此外，由于亞細胞結構的分區化特點，AM 酯加載技術存在固有的標記問題，這可以通過降低孵育溫度來解決。

 

4. 在進行熒光檢測之前，細胞應用無指示劑的培養基（允許的話，可以添加陰離子轉運抑制劑）充分洗滌，以確保洗去細胞表面的非特異性染料吸附，再另外以新鮮培養基孵育 30 分鐘保證胞內酯酶水解充分進行。這里，可能會有少量的指示劑逸出胞外從而產生背景熒光，可以通過臨將上機檢測之前，在外培養基中添加抗熒光素抗體，來降低背景。

 

5. 高通量篩選96 孔或 384 孔測量細胞內 Ca²⁺是高通量篩選必不可少的工具之一。AM 酯加載到微孔板中細胞樣本的操作可以參考 Cell Loading Guidelines.