Ca2+ GPCR 分析-鈣離子指示探針 Fluo-4, AM

 

Cat number：KFS169

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一、 產(chǎn)品描述

 

Fluo-2 早是由 Roger Tsien 博士發(fā)明的鈣離子指示劑 Fluo 系列之一，目前，F(xiàn)luo-3 和 Fluo-4 已成熟商品化。然而，F(xiàn)luo-2 在細(xì)胞內(nèi)比 Fluo-4 要更明亮，主要可能是由于大部分細(xì)胞對(duì) FLuo-2 的加載能力要高于 FLuo-4。

 

Fluo-3 成像涉及到鈣離子信號(hào)通路的多個(gè)方面，F(xiàn)luo-3 經(jīng)常應(yīng)用在流式細(xì)胞術(shù)上，如螯合劑光活化、第二信使、神經(jīng)遞質(zhì)以及細(xì)胞水平的藥理篩選。Fluo-3 在這些應(yīng)用里之所以能大量運(yùn)用主要是由于其幾個(gè)重要特性：Fluo-3 可以被氬離子激光器 488nm 激發(fā)，并在與 Ca2+結(jié)合后，發(fā)射熒光很明亮的熒光信號(hào)。Fluo-4 是 Fluo-3 以兩個(gè)氟原子取代氯原子的類(lèi)似物，這一微小的結(jié)構(gòu)變化使得 Fluo-4探針在 488nm 激發(fā)光下的熒光信號(hào)得到增強(qiáng)，信號(hào)穩(wěn)定持續(xù)，可以應(yīng)用于共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、微孔板讀數(shù)儀。

 

Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 在與 Ca2+結(jié)合后熒光增強(qiáng)，與紫外激發(fā)的探針 fura-2 和 indo-1 不同，不會(huì)發(fā)生光譜漂移。熒光光密度在與Ca2+結(jié)合后，增強(qiáng)至少 100 倍。Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 的光譜特性，見(jiàn)下表

 

Property	Fluo-2	Fluo-3	Fluo-4
Kd (Ca2+)	390 nm	325 nm	345 nm
Excitation	490 nm	506 nm	494 nm
Emission	515 nm	526 nm	516 nm

 

二、產(chǎn)品規(guī)格

 

 

組 份	KFS169	儲(chǔ)存條件
Ca2+ GPCR 分析-鈣離子指示探針 Fluo-4, AM	1 mM in 無(wú)水 DMSO，200μL	-20℃，避光
Pluronic F-127	20%（w/V），200μL	4℃

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

三、 操作說(shuō)明

加載細(xì)胞，建議使用膜透性的 AM 酯類(lèi)形式的探針，如下操作建議僅供參考。

 

1. 合適培養(yǎng)基稀釋一份染料的 DMSO 儲(chǔ)液（1mM）到 1~5μM 的終濃度，加入非離子型去污劑 Pluronic F-127 可以協(xié)助非性的 AM酯在水溶液中的擴(kuò)散?？梢院?jiǎn)單的通過(guò)先等體積混合 20%（w/V）的 Pluronic 與 DMSO，確保 Pluronic 在加載到細(xì)胞中的工作濃度是 0.02%。

 

2. 有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑 probenecid（1~2.5mM）或 sulfinpyrazone (0.1–0.25 mM)可以添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，以減少探針在胞外的脫酯現(xiàn)象。Probenecid 和 sulfinpyrazone 儲(chǔ)液基本為堿性，因此在添加到培養(yǎng)基中時(shí)需要先調(diào)整到與所用培養(yǎng)基匹配的 pH。

 

3. 細(xì)胞通?？梢耘c AM 酯探針在 20~37 度條件下孵育 15~60 分鐘，的探針加載濃度、時(shí)長(zhǎng)與溫度需要在實(shí)驗(yàn)中具體摸索確定。一般來(lái)說(shuō)為了減少可能的毒性超負(fù)荷，只要滿足足夠的熒光檢測(cè)強(qiáng)度，選擇盡可能低的染料濃度。此外，由于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分區(qū)化特點(diǎn)，AM 酯加載技術(shù)存在固有的標(biāo)記問(wèn)題，這可以通過(guò)降低孵育溫度來(lái)解決。

 

4. 在進(jìn)行熒光檢測(cè)之前，細(xì)胞應(yīng)用無(wú)指示劑的培養(yǎng)基（允許的話，可以添加陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）充分洗滌，以確保洗去細(xì)胞表面的非特異性染料吸附，再另外以新鮮培養(yǎng)基孵育 30 分鐘保證胞內(nèi)酯酶水解充分進(jìn)行。這里，可能會(huì)有少量的指示劑逸出胞外從而產(chǎn)生背景熒光，可以通過(guò)臨將上機(jī)檢測(cè)之前，在外培養(yǎng)基中添加抗熒光素抗體，來(lái)降低背景。

 

5. 高通量篩選96 孔或 384 孔測(cè)量細(xì)胞內(nèi) Ca2+是高通量篩選必不可少的工具之一。AM 酯加載到微孔板中細(xì)胞樣本的操作可以參考 Cell Loading Guidelines.