Ca2+ GPCR 分析-鈣離子指示探針 Fluo-4, AM
Cat number：KFS170
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For Research Use o
一、產(chǎn)品描述
Fluo-2 早是由 Roger Tsien 博士發(fā)明的鈣離子指示劑 Fluo 系列之一，目前，F(xiàn)luo-3 和 Fluo-4 已成熟商品化。然而，F(xiàn)luo-2 在細胞內(nèi)比 Fluo-4 要更明亮，主要可能是由于大部分細胞對 FLuo-2 的加載能力要高于 FLuo-4。
Fluo-3 成像涉及到鈣離子信號通路的多個方面，F(xiàn)luo-3 經(jīng)常應用在流式細胞術上，如螯合劑光活化、第二信使、神經(jīng)遞質(zhì)以及細胞水平的藥理篩選。Fluo-3 在這些應用里之所以能大量運用主要是由于其幾個重要特性：Fluo-3 可以被氬離子激光器 488nm 激發(fā)，并在與 Ca2+結合后，發(fā)射熒光很明亮的熒光信號。Fluo-4 是 Fluo-3 以兩個氟原子取代氯原子的類似物，這一微小的結構變化使得 Fluo-4探針在 488nm 激發(fā)光下的熒光信號得到增強，信號穩(wěn)定持續(xù)，可以應用于共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、微孔板讀數(shù)儀。
Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 在與 Ca2+結合后熒光增強，與紫外激發(fā)的探針 fura-2 和 indo-1 不同，不會發(fā)生光譜漂移。熒光光密度在與Ca2+結合后，增強至少 100 倍。Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 的光譜特性，見下表
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Property |
Fluo-2 |
Fluo-3 |
Fluo-4 |
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Kd (Ca2+) |
390 nm |
325 nm |
345 nm |
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Excitation |
490 nm |
506 nm |
494 nm |
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Emission |
515 nm |
526 nm |
516 nm |
二、產(chǎn)品包裝
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組 份 |
KFS170 |
儲存條件 |
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Fluo-4, AM |
1 mM in 無水 DMSO，200μL |
-20℃，避光 |
三、理化性質(zhì)
分子式:C51H50F2N2O23
分子量:1096.95
Cas:273221-67-3
溶解性:DMSO
四、操作說明
加載細胞，建議使用膜透性的 AM 酯類形式的探針，如下操作建議僅供參考。
1.合適培養(yǎng)基稀釋一份染料的 DMSO 儲液（1mM）到 1~5μM 的終濃度，加入非離子型去污劑 Pluro
可以協(xié)助非性的 AM酯在水溶液中的擴散。可以簡單的通過先等體積混合 20%（w/V）的 Pluro
DMSO，確保 Pluro
2.有機陰離子轉(zhuǎn)運抑制劑 probenecid（1~2.5mM）或 sulfinpyrazone (0.1–0.25 mM)可以添加到細胞培養(yǎng)基
中，以減少探針在胞外的脫酯現(xiàn)象。Probenecid 和 sulfinpyrazone 儲液基本為堿性，因此在添加到培養(yǎng)基
中時需要先調(diào)整到與所用培養(yǎng)基匹配的 pH。
3.細胞通常可以與 AM 酯探針在 20~37 度條件下孵育 15~60 分鐘，的探針加載濃度、時長與溫度需要在實
驗中具體摸索確定。一般來說為了減少可能的毒性超負荷，只要滿足足夠的熒光檢測強度，選擇盡可能低的染
料濃度。此外，由于亞細胞結構的分區(qū)化特點，AM 酯加載技術存在固有的標記問題，這可以通過降低孵育溫
度來解決。
4.在進行熒光檢測之前，細胞應用無指示劑的培養(yǎng)基（允許的話，可以添加陰離子轉(zhuǎn)運抑制劑）充分洗滌，以確
保洗去細胞表面的非特異性染料吸附，再另外以新鮮培養(yǎng)基孵育 30 分鐘保證胞內(nèi)酯酶水解充分進行。這里，
可能會有少量的指示劑逸出胞外從而產(chǎn)生背景熒光，可以通過臨將上機檢測之前，在外培養(yǎng)基中添加抗熒光素
抗體，來降低背景。
5.高通量篩選96 孔或 384 孔測量細胞內(nèi) Ca2+是高通量篩選必不可少的工具之一。AM 酯加載到微孔板中細胞
樣本的操作可以參考 Cell Loading Guidelines.
