犬(Canine)狂犬病病毒IgG抗體(RV-IgG)ELISA檢測試劑盒說明書

檢測原理
試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被狂犬病病毒抗原的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），與CUT OFF值相比較，從而判定標本中狂犬病病毒IgG抗體（RV-IgG）的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法
1.  血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
3.  細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。
5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品
1.    酶標儀（450nm）
2.    加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.    37℃恒溫箱

操作注意事項
試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶完全溶解后再使用。
實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
預處理后的樣本無需稀釋，直接取50μL加樣即可。
嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成
名稱    96孔配置    48孔配置    備注    
微孔酶標板    12孔×8條    12孔×4條    無    
陰性對照    0.5mL     0.5mL     無    
陽性對照    0.5mL     0.5mL     無    
檢測抗原-HRP    10mL    5mL    無    
20×洗滌緩沖液    25mL    15mL    按說明書進行稀釋    
底物A    6mL    3mL    無    
底物B    6mL    3mL    無    
終止液    6mL    3mL    無    
封板膜    2張    2張    無    
說明書    1份    1份    無    
自封袋    1個    1個    無    

試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法
手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置陰、陽性對照孔和樣本孔，陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL；
3.待測樣本孔加待測樣本50μL；
4.隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷
1.  試驗有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；
陰性對照孔OD值平均值≤0.15。
2.  臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
3.  陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性
4.  陽性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性

試劑盒性能
準確性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15，說明試驗結果有效。
特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
重復性：板內、板間變異系數均小于15%。
貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
有效期：6個月

免責聲明
1.試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。
2.嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。