F04熒光探針采用可見光激發(fā),與傳統(tǒng)紫外光激發(fā)熒光探針相比,儀器適用范圍更廣泛,具有更強(qiáng)探針吸收性能,使得更低濃度探針即可成功檢測Ca2+變化,從而降低了對活細(xì)胞光毒性,檢測敏感度更高。

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檢測方法：

● 流式細(xì)胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 激光共聚焦/熒光顯微鏡/流式細(xì)胞儀/熒光酶標(biāo)儀/光度計(jì)等 ● 離心機(jī) ● 移液器 ● PBS或HBSS

使用注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量試劑管裝試劑開蓋前請短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開蓋時(shí)液體灑落。

● 鈣離子染色液為DMSO 溶液,冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱,否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

● 探針為了便于觀察防止誤操作導(dǎo)致?lián)p失,在試劑盒中時(shí)是采用透明管包裝,收到后可以離心移入干燥黑色避光密封管或者用鋁箔包裹避光。

● 熒光染料均存在淬滅問題,請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。

● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 染色后立即進(jìn)行分析。

● F04探針易受潮,穩(wěn)定性較差,注意干燥保存。從冰箱取出后,請確認(rèn)在干燥環(huán)境放至室溫后再開封。

● F04 探針母液時(shí)要用干燥的新吸頭,不能使用含水的吸頭。

● 未使用完的F04 探針母液請擰緊螺旋蓋,避免受潮失效。母液遇水極易分解,如果長期不用,建議根據(jù)每次使用量分裝保存,用封口膜封口,并用鋁箔紙包裹,放在一個(gè)密閉性能好的塑料袋中,并放入一包干燥劑,在≤-20℃密封避光保存。

● F04探針工作液含水,配制后不可以長期保存,須現(xiàn)配現(xiàn)用。

● F04融解后離心至管底部再打開螺旋蓋,防止開蓋時(shí)損失。

● 可以在染色溶液中加入等體積的20% Pluronic F127溶液（可選步驟）,Pluronic F127可以幫助F04更快進(jìn)入細(xì)胞,不建議在Pluronic F127中長期保存F04溶液。

● 標(biāo)記條件因細(xì)胞的種類而異,據(jù)不同樣本實(shí)際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整,每次正式實(shí)驗(yàn)前先摸索一下細(xì)胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養(yǎng)時(shí)間等,找到最佳實(shí)驗(yàn)條件。以下方法僅供參考。

使用方法：

1、染色工作液的配制：

用 HBSS稀釋F04溶液500倍-1000倍,配制成F04染色工作液。

【注】：

● 推薦該探針加載終濃度在500-1000倍稀釋,具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。500-1000倍稀釋適合大部分細(xì)胞樣本，有些細(xì)胞可能需要使用200倍稀釋。

● 為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性,建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

● 工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用,避免反復(fù)凍存。

● 不能用含血清的培養(yǎng)基稀釋探針，可以用相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基稀釋探針。

2、收集培養(yǎng)好的待測細(xì)胞樣本,用HBSS洗滌細(xì)胞3次。

【注】：

● 沒有HBSS也可以用PBS洗細(xì)胞。

● 培養(yǎng)基血清中的酯酶會(huì)降解F04,從而降低F04進(jìn)入細(xì)胞的效果。所以加工作液之前必須洗滌細(xì)胞,盡量去除培養(yǎng)基殘留。

● 可以收集細(xì)胞后染色，也可以原位染色。

3、離心去上清后,將F04染色工作液加入細(xì)胞,在37℃孵育20-60分鐘。

【注】：

● 關(guān)于孵育的時(shí)間,首次預(yù)實(shí)驗(yàn)不能確定,建議先孵育30分鐘。

● 根據(jù)熒光效果：如果太強(qiáng),適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱,適當(dāng)延長時(shí)間。

● 染色工作液加入量以覆蓋細(xì)胞即可。

● 如果F04探針進(jìn)入細(xì)胞的效果不好，可以向F04染色溶液中加入適量20% Pluronic F127溶液，最終稀釋至其濃度為0.04-0.05%，Pluronic F127可以防止F04在HBSS中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞。

● Pluronic F127可降低F04探針的穩(wěn)定性，因此只能在配制工作液時(shí)加入，不能將其加入儲(chǔ)存液長期保存。

4、用HBSS洗滌細(xì)胞2-3次。

5、用HBSS重懸細(xì)胞。在37℃下再繼續(xù)孵育20-40分鐘。

6、然后用該細(xì)胞進(jìn)行熒光鈣離子檢測。激發(fā)波長488-495nm,發(fā)射波長516nm。

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